Микробиология

51

Рисунок 4 - Аппаратурно-технологическая схема мембранной стерилизации жидкостей

Условные обозначения АТС: Е1 - емкость со стерилизуемой жидкостью; Е2 - емкость со стерильной жидкостью; Н1 - перистальтический насос; Ф1, Ф2 - аппараты разделительные АР -0,2; КП1, КП2 - манометры;

В1, В2 - запорные вентили.

Порядок работы заключается в следующем:

Исходный раствор из емкости Е1 со стерилизуемой жидкостью перистальтическим насосом Н1 подается на фильтры Ф1 и Ф2, исходный раствор возвращается в емкость Е1, а стерильный раствор, прошедший через фильтры Ф1 и Ф2 поступает в приемную емкость для стерильной жидкости Е2.

Перед началом процесса стерилизующей фильтрации гибкими коммуникациями соединяются емкости Е1, через насос Н1, фильтры Ф1 и Ф2, и емкость Е2.

Перед началом фильтрации открывается вентиль В1, включается насос Н1 и при появлении в гибких коммуникациях первой порции жидкости открывается

вентиль В2 (для избежания возможности создания гидроудара и разрыва пор мембраны). Затем с помощью вентиля В1 усиливается значение рабочего давления в пределах 0,15 МПа в соответствии с рекомендациями Ю.И. Дытнерского. Для чего на линии входа давление устанавливается в пределах(0,15… 0,20) МПа, на линии выхода - в пределах (0…0,05) МПа.

Величина рабочего давления Рр для микрофильтрации рассчитывается по формуле:

где: Р1 - давление на линии входа в разделительный аппарат, МПа; Р2 - давление на линии выхода из разделительного аппарата, МПа.

Дезинфекционная обработка системы установки. Одной из основных в технологии мембранной стерилизации является операция химической стерилизации. Для обработки мембранных фильтров используются различные дезинфектанты такие, как растворы формалина, первомура (раствор смеси муравьиной кислоты и перекиси водорода в соотношении 1:1), перекиси водорода.

52

В таблице 1 приведены концентрации и температуры рабочих растворов, обеспечивающие гибель различных видов микроорганизмов.

Таблица 1 - Дезинфицирующие растворы Н2О2

Из таблицы 1 следует, что наиболее эффективным режимом обработки мембран и коммуникаций от широкого спектра микробных культур является раствор, в котором массовая доля пероксида водорода составляет 6 %.

Стерилизацию гидравлической системы установки проводят путем заполнения дезинфицирующим раствором с кратковременной, не менее 40 мин., циркуляцией, создавая давление до 0,01 МПа (с целью обработки волокна и коммуникаций) для сбора фильтрата, после чего и выполняют отмывку стерилизующего агента дистиллированной водой.

Литература по теме занятия

1.Дытнерский Ю.И. Мембранные процессы разделения жидких смесей. – М., 1975.

2.Фильтрование. Фильтры. Большая медицинская энциклопедия. Изд. 3-е.

Т.26. С. 325-326. – М., 1985.

3.Воробьева Л.И. Техническая микробиология. – М., 1987.

4.Промышленная микробиология / Под ред. Н.С. Егорова. – М., 1989.

5.Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. Пер. с англ. В 2-х

частях. Ч. 2. – М., 1989.

6.Черкасов А.Н., Пасечник В.П. Мембраны и сорбенты в биотехнологии. – М., 1991.

53

2.МИКРОБНЫЕ КУЛЬТУРЫ. ПИТАНИЕ, РОСТ

ИКУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

Лабораторная работа № 2.1.

Подготовка посуды для микробиологических исследований. Виды питательных сред. Приготовление жидких, полужидких и плотных питательных сред

1. Общие сведения

Микроорганизмам для нормального роста, развития и размножения необходим комплекс питательных, веществ, позволяющий поддерживать в рабочем состоянии все структурные компоненты и функциональную активность микробной клетки. Поэтому в микробиологии в целом и биотехнологии в частности успехи в культивировании микроорганизмов в значительной степени определяются знанием их физиолого-биохимических особенностей и подбором питательных сред.

Питательные среды применяют при выращивании микроорганизмов и выделении их в чистой культуре, при получении биотехнологическими методами различных микробных препаратов (антибиотиков, вакцин, аминокислот, биостимуляторов, витаминов и т.д.) и изучении свойств микробов. Состав питательных сред и условия культивирования микроорганизмов в значительной степени определяют результаты микробиологических исследований.

Для построения белков клетки требуется азот, углерод, водород, кислород. Снабжение водородом и кислородом осуществляется за счет воды. Источники углерода многочисленны и многообразны. На первом месте стоят сахара, многоатомные спирты и кислоты. Углерод является также составной частью всех органических соединений, в том числе белков, пептонов, аминокислот. Поэтому в составе питательных сред специальные дополнительные источники углерода не нужны.

Основное внимание следует уделять источникам азота. Все искусственные питательные среды как самостоятельно изготавливаемые в лабораториях, так и" выпускаемые централизованно (сухие питательные среды), имеют в своей основе вещества, содержащие азот. В качестве азотистого субстрата для изготовления питательных сред служат в основном белки животного происхождениямясо (преимущественно говяжье), рыба, мясокостная мука, казеин. В ряде случаев используются заменители полноценного мясаотходы мясомолочной промышленности, плаценту, кровяные сгустки, а также дрожжи и белки растительного происхождения (соевые бобы, горох, ячмень и др.).

Микробам для нормального роста и развития нужны микроэлементыне- большие количества некоторых металлов(железо, медь, марганец и др.). Микроэлементы участвуют в образовании коферментов, посредством которых сложные вещества подвергаются гидролизу до более простых и растворимых в воде соединений, ассимилируемых микробами. Не-органические вещества - соли, содержащие хлор, фосфор, натрий, калий, кальций, магний и некоторые другие элементы,

54

нужны для построения и нормального функционирования различных структур микробной клетки. Ростовые вещества или "факторы роста", которыми в основном являются витамины группы В, играют важную роль стимуляторов и регуляторов обмена веществ у микробов.

Синтетическим питательными средами называются такие, которые со-

стоят из растворов химически чистых соединений в точно установленных дозировках. В качестве источника азота обычно используют различные аминокислоты или аммонийные соли.

По консистенции питательные среды могут быть плотными, жидкими и полужидкими. Плотные среды готовят путем добавления к жидкой основе1.5- 2% агара, полужидкие 0.3-0.4% агара, который представляет собой сложный полисахарид - продукт переработки особого вида морских водорослей, и в застывшем состоянии придает среде плотность. Агар плавится при температуре 80-86°С

изатвердевает при температуре около40°С. В некоторый случаях для получения плотных питательных сред используют желатин(10-15%). Такие естественные среды, как свернутая сыворотка крови, свернутый яичный белок, сами по себе являются плотными.

По целевому назначении питательные среды делят наосновные, элективные и дифференциально-диагностические. К основным относятся среды,

применяемые для выращивания многих бактерий. По составу принято выделять естественные или натуральные среды неопределенного состава и синтетические среды, о которых уже говорилось выше. К основным средам, используемым в

.микробиологии, относят триптические гидролизаты казеина, рыбных продуктов, мясокостной муки и др., из которых готовят жидкую среду - питательный бульон

иплотную - питательный агар. Такие среды служат основой для приготовления более сложных: сахарных, кровяных, сывороточных и др., удовлетворяющих пищевой потребности более требовательных патогенных бактерий.

Элективные питательные среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида в местах их естественного обитания из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. Создавая элективные (для определенных микробов) питательные среды, исходят из биологических особенностей, которые, отличают данные микроорганизмы от большинства других. Например, избирательный рост стафилококка наблюдается при повышенной концентрации хлорида натрия, холерного вибриона - в щелочной среде.

Дифференциально-диагностические питательные средыприменяются для разграничения отдельных видов или групп микроорганизмов. Принцип построения дифференциально-диагностических сред основан на том, что равные виды бактерий различаются между собой по биохимической активности и имеют неодинаковый набор ферментов, расщепляющих субстраты, входящие в состав питательной среды. Компонентами дифференциально-диагностических сред являются: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий; б) определенный химический субстрат (например, лактоза в среде Эндо), различное отношение к которому является диагностическим признаком для микроорганизмов; в цветной индикатор(например, индикатор Андреде), изменение цвета

55

которого свидетельствует о биохимической реакции и наличии данной ферментной системы у исследуемого микроорганизма. Дифференциальнодиагностические среды широко используются в диагностических исследованиях для идентификации бактерий.

2. Содержание лабораторного занятия

Цели занятия: - познакомиться с основными ингредиентами, используемыми для приготовления питательных сред;

-освоить технику приготовления основных питательных сред и посуды для культивирования микроорганизмов;

-изучить разные виды питательных сред;

-освоить технику посева микроорганизмов в жидкие, полужидкие и на плотные питательные среды.

Материалы и оборудование

Вертикальный автоклав, лабораторная посуда (матрацы, чашки Петри, флаконы, пипетки, бактериологические петли), Стандартные сухие питательные среды Эндо, Левина, Плоскирева, агар Д, фосфат калия или натрия одноили двузамещенный, рН-метры, индикаторы, медицинские груши с резиновыми трубками, дистиллированная вода, фильтровальная бумага, бумага для подготовки посуды к стерилизации, мерные цилиндры, газовые горелки, штативы с пробирками.

Ход работы

Реакция среды

Для роста разных видов микробов требуется определенная реакция среды, которая выражается показателем концентрации водородных ионов(рН). Для большинства бактерий устанавливают рН среды в пределах6.8-8.0. Ориентировочную реакцию питательной среды можно устанавливать стандартной индикаторной бумагой. Чаще всего для ее изготовления используют индикатор крезоловый красный (диапазон изменения цвета смотри табл.1). Для более точного измерения среды используют рН-метр.

Для успешного роста микробов недостаточно правильно установить первоначальную реакцию питательной среды. Микроорганизмы в процессе роста образуют ряд кислот, что делает реакцию среды кислой и является основной причиной прекращения роста. Во избежание этого необходимо создать условия, препятствующие резкому изменению реакции среды. Отчасти препятствуют изменению рН азотистые вещества, имеющиеся в среде. Чем больше аминокислот в субстрате, тем большими буферными свойствами обладает среда. В настоящее время ко многим питательным смесям прибавляют еще фосфатные буферные смеси.

Индикаторы

Индикаторы, меняющие свай цвет при изменении рН среды, используют не только для определения реакции среды. Их вводят также в состав специальных сред, которые служат для выявления биохимических свойств микробов. Измене-

56

ние цвета среды указывает на образование кислоты или щелочи при ферментативной деятельности микробов. Известны индикаторы, приобретающие ту или иную окраску лишь при щелочной или кислой реакции, вне этой реакции они бесцветны. Так, среда, содержащая индикатор Андреде меняет свою интенсивную красную окраску при значениях рН=5.3-5.5, в случае подщелачивания среды, становится бесцветной - при рН=7.2. Фенолфталеин бесцветен при кислой реакции, а окраску приобретет з диапазоне рН=8.3-10.0.

Более удобны двухцветные индикаторы, имеющие разную окраску в кислой и щелочной среде. Наиболее широко распространены индикаторы Кларка (табл.1). Они имеют различную окраску в кислой и щелочной среде. В средах, содержащих такие индикаторы, хорошо выражены переходные тона. Кроме того, диапазон чувствительности индикаторов Кларка весьма широк.

Приготовление питательных сред

Белковой основой большинства сред является питательный бульон. В зависимости от состава среды другие ингридиенты добавляют к питательному бульону.

57

Таблица 1 - Наиболее распространенные индикаторы Кларка

58

Существуют два способа приготовления питательного бульона:

1.Ha мясной воде с добавлением готового пептона, который представляет собой смесь разнообразных частиц распада белка, не свертывающихся при нагревании (альбумозы, пептоны, пептиды, незначительное количество аминокислот) - это так называемый мясо-пептонный бульон.

2.На продуктах гидролиза исходного сырья при помощи ферментов (трипсина - бульон Хоттингера, пепсина - бульон Мартена) или кислот; среды этой группы богаче аминокислотами.

От азотистого состава мясо-пептонных сред и от степени расщепления белка в мясных и прочих гидролиаатах зависит содержание в среде общего и аминного азота. Отношение количества аминного азота к количеству общего выражает степень расщепления общего азота. Обычно эта величина выражается в процентах. При изготовлении питательных сред необходимо определять количество общего и аминного азота как основных показателей качества.

Для хорошего роста микробов необходимо содержание в100 мл не менее 200-300 мг общего азота при наличии в этом количестве аминного азота(аминокислот) в среднем в пределах 25-30%. Принимая во внимание, что для приготовления питательного бульона полуфабрикаты разводят в несколько рае, необходимо доводить гидролиз основного сырья(мяса, казеина и прочих субстратов) до максимального накопления общего азота. Содержание общего и аминного азота в полуфабрикатах представлено в табл.2.

Таблица 2 - Содержание общего и аминного азота в полуфабрикатах

Мясная вода

Мясо, очищенное от жира и сухожилий, пропускают через мясорубку и заливают двойным количеством холодной водопроводной воды, т.е. на 1 кг мяса берут 2 л воды, интенсивно перемешивают и ставят на огонь и кипятят1 ч. Накипь снимают до кипения. По окончании кипения дают мясной воде немного отстояться, фильтруют через полотно или фильтровальную бумагу, доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают по бутылкам и стерилизуют при давлении 1 атм (120°С) 30 мин. После стерилизации на дне и на стенках бутыли образуется осадок из свернувшихся белков. Поэтому перед приготовлением бульона мясную воду снова фильтруют. Мясная вода (мясной экстракт) содержит минеральные вещества, углеводы и витамины.

59

Мясо-пептонный бульон

К мясной воде прибавляют1% пептона и 0.5% хлорида натрия, кипятят при перемешивании. После растворения пептона устанавливают рН с учетом того, что среда после стерилизации становится более кислой. Например, для получения в готовом бульоне рН=7.3-7.5 надо до стерилизации установить рН не ниже 7,8 или еще выше (3.0-8.2), если бульон предназначается для приготовления сахарного сиропа или плотной среды. Для стабилизации рН рекомендуется к бульону добавлять фосфатные буферные смеси. Кипятят бульон 30-40 мин в сосуде, закрытом крышкой. Отмечают уровень бульона и при выкипании добавляют дистиллированную воду до первоначального объема. Можно сразу прилить 10% дистиллированной воды на выкипание. После окончательного установления рН проводят автоклавирование при 1 атм в течение 30 мин, для чего бульон разливают по бутылкам. После автоклавирования бульон оставляют в бутылках для отстаивания. По мере надобности бульон фильтруют, разливают по пробиркам или флаконам и стерилизуют30 мин под давлением 1 атм. После стерилизации проводят контроль рН.

Фосфатная буферная смесь

Готовят 1/15 М растворы фосфата калия однозамещенного и фосфата натрия двузамещенного по следующей прописи: КН2РО4 - 9.078 г на 1 л дистиллированной воды, Na2HPО4×2H2О - 11.876 г на 1 л дистиллированной воды. Растворы смешивают в определенных объемах в зависимости от рН, который необходимо получить (таблица 3).

Таблица 3 - Приготовление фосфатных буферных смесей

Триптические перевары (гидролизаты)

Приготовление бульона из перевара по Хоттингеру является более экономичным, чем применение мясо-пептонных сред, из одного и того количества мяса получают в 5-10 раз больше бульона. Кроме того, для переваривания можно использовать заменители мяса. Наконец, присутствие в переварах значительного количества аминокислот создает буферность, а, следовательно, и большую стабильность рН среды. Технология приготовления переваров по Хоттингеру более трудоемка и более длительна. Мясо дополнительно подвергается ферментативному перевариванию в присутствии комплекса ферментов поджелудочной железы (фарш из железы) в течение 1-2 недель. Таким путем можно получать перевары из казеина, плаценты, кровяных сгустков.

60

Казеиновый перевар (гидролизат)

Пищевой кислотный казеин в виде сухого желтоватого порошка является отходом молочной промышленности, характеризуется полноценным составом аминокислот и высокой питательностью. Казеиновый перевар (гидролизат) можно готовить двумя способами - ферментативным и кислотным.

При ферментативном способе нагревают водопроводную воду до45°С, подщелачивают в открытом сосуде до рН=8.2, прибавляют 7-10% сухого казеина, высыпая его постепенно при непрерывном перемешивании. После прибавления казеина снова устанавливают прежнюю реакцию среды(рН=8.2). Размешивание и подщелачивание проводят несколько раз через30 минут, пока казеин не разбухнет. Тогда добавляют 7-10% фарша из поджелудочной железы или сухой панкреатин в количестве 0.5% и выше (в зависимости от его активности), хорошо размешивают и снова подщелачивают до прежней реакции. Через 30 минут снова устанавливают, реакцию среды и переливают, смесь в бутыль. В дальнейшем поступают так же, как при изготовлении перевара Хоттингера. Казеин подвергается ферментативному перевариванию в присутствии ферментов поджелудочной железы в течение 1-2 недель при периодическом (1 раз в 3-4 дня) перемешивании с контролем рН.

Для приготовления кислотного гидролиаата казеин отмывают 0.2%, раствором уксусной кислоты в течение 5-10 дней (25 мл 80%-ной уксусной кислоты на 10 л воды). В первый день раствор меняют 3 раза, а в последующие 5-6 дней - по 1 разу в день. Затем казеин промывают дистиллированной водой, хорошо отжимают и высушивают при температуре60-70°С или при комнатной температуре. Гидролиз сухого казеина проводят под давлением с помощью крепкой соляной кислоты (химически чистая с относительной плотностью1.19). Для этого в стеклянной посуде (колба или бутыль вместимостью 2 л) смешивают 400 г казеина, 400 г солянок кислоты и£00 мл дистиллированной воды. Бутыль закрывают ватно-марлевой пробкой и бумажным колпачком. Смесь автоклавируют при 1S7°C в течение 3-4 ч. После азтоклавирования гидролизат двукратно разводят в дистиллированной воде и фильтруют через ткань или бумагу. Затем объем фильтрата доводят водой до3 л и осветляют активированным углем. Для этого добавляют 50 г угля на 1 л фильтрата. Смесь кипятят в течение 10 минут и пропускают через бумажный фильтр. Из указанного количества казеина получается примерно 3 л гидролизата, который представляет собой прозрачную жидкость слегка желтоватого цвета.

Дрожжевой аутолизат

Дрожжевой аутолизат используют для приготовления основного питательного субстрата в плотных агаровых средах. Хлебные и пивные дрожжи содержат 40-60% азотистых веществ, а также ряд ферментов, способствующих самоперевариванию. При аутализе дрожжей образуются продукты, характерные для триптического переваривания животных белков. Дрожжевые среды обеспечивают пышный рост, несмотря на низкое содержание общего азота и слабую степень его расщепления.