161

3. Результаты исследований работы 2 записать по форме:

3. Техника безопасности

При выполнении практического занятия необходимо неукоснительно соблюдать требования инструкции по технике безопасности и производственной санитарии и правила проведения лабораторных работ в микробиологической лаборатории.

4.Вопросы по теме занятия

1.Ознакомиться с влиянием физических факторов на микроорганизмы.

2.Знать порядок, по которому устанавливается влияние температуры на изучаемый микроорганизм.

3.Знать природу действия низких и высоких температур на микроорганизмы.

4.Минимальная, максимальная и оптимальная температуры развития микроорганизмов.

5.Температурные пределы гибели бесспоровых бактерий, вегетативных клеток споровых бактерий, дрожжей и плесеней, а также спор бактерий.

6.Способы хранения микроорганизмов основанные на использовании низких и высоких температур.

7.Знать, каким образом устанавливается влияние Уф– лучей на исследуемый микроорганизм.

8.Знать величину длины бактерицидных Уф – лучей и источники их излучения.

9.Знать природу действия Уф – лучей на микроорганизмы.

10.Эффект действия Уф – лучей на микроорганизмы.

11.Применение Уф – лучей на практике.

162

5.Литература по теме занятия

1.Гусев М. В., Минеева Л. А. Микробиология. – М., 2003.

2.Шлегель Г. Г. Общая микробиология. – М., 1987.

3.Кашнер Д. Жизнь микробов в экстремальных условиях. Пер. с англ. под ред. Калакуцкого Л. В., Кондратьевой Е. Н. – М: Мир, 1989.

4.Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрем Дж. Мир микробов. Пер. с англ. Кондратьевой Е. А. – М., 1973.

5.Мудрецова – Висс К. А., Чистяков Ф. М. Микробиология. – М., 1971.

6.Логинова Л. Г., Головачева Р. С., Егорова Л. А. Жизнь микроорганизмов при высоких температурах . – М.. 1966.

163

Лабораторная работа № 4.4.

Изучение влияния химических факторов на жизнедеятельность микроорганизмов (рН, антисептики)

1. Общие сведения

Влияние реакции (рН) среды

Отношение микробов к реакции среды очень разнообразно. Каждый вид микроорганизмов развивается в определенных пределах значений рН среды. При минимальном и максимальном значении рН жизнедеятельность микроорганизмов протекает очень медленно, при оптимальном - наиболее интенсивно. При значении рН ниже минимального и выше максимального жизнедеятельность микроорганизмов прекращается и наблюдается даже их отмирание. Для большинства плесневых грибов и дрожжей наиболее благоприятной является слабо-кислая среда, для бактерий - нейтральная.

Влияние фитонцидов

Фитонциды - это вещества, выделяемые высшими растениями и обладающие антимикробным действием. Они различны по химической природе и силе действия. Одни из них вызывают гибель микроорганизмов, другие лишь угнетают их развитие. Фитонциды обладают избирательностью: каждый действует только на определенные микроорганизмы. Эффект действия зависит от времени, условий и устойчивости микроорганизма.

Некоторые фитонциды применяются в медицинской практике. Ведутся исследования по изучению возможности применения фитонцидов в целях удлинения сроков хранения скоропортящихся пищевых продуктов.

Влияние антисептиков

Антисептики - это химические вещества, губительно действующие на микроорганизмы.

Интенсивность действия того или иного антисептика зависит от природы этого вещества, концентрации его в среде, времени, условий воздействия и устойчивости микроорганизмов. Различные микроорганизмы проявляют неодинаковую чувствительность к одному и тому же антисептику.

Антисептики широко применяются для дезинфекции(обеззараживания) складских помещений, холодильных камер, их оборудования, тары, питьевой воды и в медицине.

Некоторые антисептические вещества добавляют в пищевые продукты в целях удлинения сроков их хранения, но в очень ограниченных дозах, так как многие из них являются ядовитыми для человека.

В настоящее время для консервирования некоторых пищевых продуктов применяют сорбиновую кислоту и ее соли в дозах, безвредных для людей, но подавляющих развитие микроорганизмов. Особенно эффективно действие сорбиновой кислоты на плесневые грибы и дрожжи.

164

2. Содержание лабораторного занятия

Цели занятия

-Произвести оценку интенсивности роста бактерий на питательной среде

сразличными значениями показателя рН.

-Установить влияние концентрации антисептика на рост бактерий(куль-

туры E.coli М-17).

Материалы и оборудование

1.Культуры микроорганизмов в пробирках (E. coli М-17).

2.Жидкие и плотные питательные среды(эритрит – агар, 2% - й раствор

пептона).

3.Стандарты мутности со шрифтовыми таблицами.

4.Бактериологические петли, спиртовки, пипетки, шпатели, штатив для пробирок на 20 гнезд, микропипетка.

5.Стерильные пробирки, чашки Петри, чашки Петри с плотной питательной средой.

6.Разводящий буферный или физиологический растворы.

7.Холодильник бытовой шкафного типа.

8.Термостат.

9.Прибор рН-метр тип ЭВ-74 или индикаторы Кларка.

10.Антисептики: монохлорамин, перекись водорода.

План занятия

1.Введение – 5 мин.

2.Контроль исходного уровня знаний – 10 мин.

3.Собеседование и коррекция знаний – 25 мин.

4.Самостоятельная работа – 75 мин.

5.Подведение итогов занятия – 5 мин.

6.Сбор отчетов для проверки преподавателем – 5 мин.

Ход работы

Работа 1. Изучение интенсивности роста бактерий(E. coli М-17) на питательной среде с различным значением показателя рН: 3, 6 и 9 ед.рН

1.Расплавить питательный агар. Скорректировать показатель рН питательной среды до требуемых значений(3, 6 и 9 ед.рН) химическими реактивами.

Вконтрольном образце не проводится корректировка показателя рН. Разлить в чашки Петри эритрит-агар. Одновременно с этим подготовить чашки с питательным агаром в потребном количестве к работе 2.

Промаркировать чашки Петри с указанием значения показателя рН опыта, фамилии студента.

2.Осуществить посев приготовленной микробной культурыE. coli М-17 на плотную питательную среду. Оптическая концентрация посевных культур по стандарту мутности ГИСК должна соответствовать одному млрд. кл. / мл.

165

3.Суспензию бактерий брать для посева стерильной бактерииологической петлей, которую стерилизовать в пламени спиртовки перед каждым посевом.

4.По истечение 48 часов произвести просмотр чашек с культурами бактерий. Во всех вариантах опыта выявить отсутствие или наличие роста, а также его интенсивность. При оценке роста пользоваться условными обозначениями: - отсутствие роста; + - слабый рост; ++ - умеренный рост; +++ - обильный рост.

Работа 2. Определение влияния концентрации антисептика на рост бактерий культуры E. coli М-17

1.Расчетно по сухому веществу приготовить в объеме10 мл растворы антисептика (монохлорамина) с концентрациями 0,2; 0,5; 1,0 и 3,0 %.

2.Чашки Петри с эритрит-агаром по одной на каждую рабочую концентрацию готовятся при выполнении работы 1.

3.Определить оптическую концентрацию по стандарту мутности, предос-

тавленной рабочей культуры E. coli М-17 и осуществить ее разведение до содержания микробов 104 млрд.кл./мл.

4.Промаркировать чашки Петри с указанием концентраций антисептика, фамилии студента.

5.Выполнить посев микробной суспензии с концентрацией равной104 млрд.кл./мл на плотную питательную среду, в течение 20…30 минут чашки подсушить.

6.С помощью микропипетки в объеме по 10 мкл нанести исследуемый антисептик в четырех секторах каждой засеянной чашки. Концентрацию антисептика при этом изменяйте (0,2; 0,5; 1,0 и 3,0 %). Контролем является посев на чашки без внесения антисептика.

7.Поставить выращивать посевы с антисептиком в термостат при температуре 370С.

8.По истечение 48 часов инкубирования произвести просмотр чашек. Определить площадь сплошного газона роста микробной культуры. Установить площадь зон отсутствия роста (места нанесения растворов антисептика).

9.Эффективность действия антисептика (выразить в процентах) определить путем разности размеров площадей газонов контрольных чашек (или чашки)

иопытных чашек, где измеряется площадь участков, на которых рост отсутствует.

Материалы, представляемые в отчет по лабораторной работе

1.Описать последовательность проведения работ.

2.Результаты работы 1 записать по форме:

167

4. Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрем Дж. Мир микробов. Пер. с англ. Кондратьевой Е. А. – М., 1973.

5.Мудрецова – Висс К. А., Чистяков Ф. М. Микробиология. – М., 1971.

6.Логинова Л. Г., Головачева Р. С., Егорова Л. А. Жизнь микроорганизмов при

высоких температурах. – М.. 1966.

168

Приложение

Таблица – Физико-химические свойства основных дезинфицирующих средств*

* Дезинфицирующие средства (син. дезинфекционные средства) – средства, применяемые для уничтожения возбудителей инфекционных болезней в -ок ружающей среде.

169

5. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ

Лабораторная работа № 5.1.

методы изучения генетики микроорганизмов. Летальное и мутагенное действие ультрафиолетовых лучей на клетки микроорганизмов.

Отбор спонтанных и индуцированных мутантов бактерий

1. Общие сведения

Огромное значение в становлении иразвитии генетики микроорганизмов имел выбор бактерий и вирусов в качестве основных модельных систем для изучения общегенетических закономерностей. Упомянутые микроорганизмы, в отличие от такого классического объекта как мушка дрозофила, обладают уникальными для генетических экспериментов свойствами:

1.Высокой скоростью размножения, обеспечивающей получение в лабораторных условиях многомиллиардных популяций в течение короткого времени (нескольких часов).

2.Гаплоидность, т.е. наличие одной хромосомы, что устраняет явление доминантности.

3.Половой дифференциацией, заключающейся в существовании донорных и реципиентных клеток, соответственно отдающих или воспринимающих генетическую информацию.

4.Наличием у бактерий обособленных фрагментов ДНК-плазмид, транспазонов и Is-последовательностей, позволяющих проводить разнообразные манипуляции с наследственной информацией микробной клетки и являющихся удобными инструментами для генетической инженерии.

5.Высокой разрешающей способностью генетических методов анализа свойств бактерий и вирусов, позволяющих обнаруживать малейшие изменения этих микроорганизмов.

Бактериальная клетка имеет одинарный набор генов(нет аллелей). Хромосома бактерий является полинуклеотидом(ДНК). Она су-перспирализована и замкнута в кольцо: содержит от 1000 до 5000 генов (в среднем). Аналогично хромосоме в цитоплазме бактерий располагаются ковалентно замкнутые кольца ДНК внехромосомных факторов наследственности - плазмид. Хромосома и плазмида способны к автономному самоконированиюрепликации, поэтому их называют репликонами.

Свойства микроорганизмов, как и любых других организмов, определяются их генотипом, т.е. совокупностью генов данной особи. Термин "геном" в отношении микроорганизмов - синоним понятия "генотип". Фенотип представляет собой внешнее выражение результата взаимодействия между генотипом и окружающей средой, т.е. проявление генотипа в конкретных условиях обитания. Фенотип микроорганизмов хотя и зависит от окружающей среды, но контролируется генотипом, т.к. характер и степень возможных для данной клетки фенотипических изменений определяется набором генов, каждый из которых представлен определенным участком молекулы ДНК.

170

В основе изменчивости лежит либо изменение реакции генотипа на факторы окружающей среды, либо изменение самого генотипа в результате мутации генов или их рекомбинации. Мутации (от лат. mutatio -изменение) - стойкие изменения в генотипе (первичной структуре ДНК), которые выражаются в наследственно закрепленной утрате или изменении каких-либо свойств микроорганизма (морфологических, культуральных, биохимических, биологических и др.), которые не связаны с рекомбинационным процессом.

Микроорганизмам, как и клеткам высших организмов, свойственны генетические рекомбинации. Известно, что генетические рекомбинации у клеток эукариот совершаются путем реципрокного(взаимного) обмена фрагментами хромосом в ходе процессов, сопровождающих половое размножение. При таком обмене генетическим материалом из двух рекомбинирующих родительских хромосом образуются две рекомбинантные хромосомы. Применительно к родительским клеткам это означает, что в результате рекомбинации возникают две рекомбинантные особи.

Прокариотам не свойственно половое размножение. Рекомбинация у них происходит в результате антигенных перестроек, заключающихся в изменении локализации генов в пределах хромосомы, или при проникновении в воспринимающую наследственную информацию клетку, называемую в этом случае реципиентом, части ДНК донора (клетка, отдающая ДНК). В результате рекомбинаций у прокариот образуется только один рекомбинант, генотип которого пред-

ставлен в основном генотипом реципиента с включенным в него фрагментом ДНК донора.

Генетические рекомбинации происходят при участии ряда ферментов в пределах отдельных генов или групп сцеплений генов. Передача генетического материала от одних бактерий к другим происходит путем конъюгации, трансформации и трансдукции.

Ненаследственная (фенотипическая) изменчивость или модификация ка- кого-либо признака (нескольких признаков) обусловлена влиянием внутриили внеклеточных факторов на проявление генотипа. При устранении фактора, вызвавшего модификацию, данные изменения исчезают.

Наследственная (генотипическая) изменчивость, связанная с мутациями, является мутационной изменчивостью, а связанная с рекомбинациями называется рекомбинационной изменчивостью. Генотипическая изменчивость является тонким инструментом генного инженера при получении штаммов микроорганизмов с новыми практически полезными в биотехнологии свойствами.

2. Содержание лабораторного занятия

Цели занятия:

-познакомиться с основными понятиями и терминами, встречающимися при изучении генетики микроорганизмов;

-познакомиться с классическими методами изучения генотипической изменчивости микроорганизмов: отбором спонтанных и индуцированных мутантов бактерий, трансдукцией, трансформацией, плазмидной и хромосомной ДНК, конъюгацией плазмидной ДНК;