171

- освоить технику отбора спонтанных и индуцированных мутантов бакте-

рий;

-освоить технику получения рекомбинантных штаммов бактерий при конъюгационном переносе плазмид;

-освоить технику получения рекомбинантных штаммов бактерий при трансформации хромосомной ДНК гетерологичных штаммов;

-освоить технику получения реплик бактериальных клонов мутантов и рекомбинантов (трансдуктантов, трансформантов, трансконъюгантов).

Материалы и оборудование

Лабораторная посуда (стерильные чашки Петри, пипетки, флаконы, бактериологические петли), плотные питательные агаровые среды в чашках Петри и матрацах, антибиотики (рифампицин, стрептомицин, канамицин, налидиксовая кислота), спиртовки, репликаторы, термостат, штативы с пробирками для приготовления разводок, препараты ДНК для трансформации(хлороформенный лизат Str-мутанта кишечной палочки), штамм-донор кишечной палочки с плазмидой

RР1.

Ход работы

Мутации Мутации представляют собой наследственно закрепленные изменения

свойств (морфологических культуральных, биохимических, биологических и др.), не связанные с рекомбинационным процессом. Мутации проявляются в фенотипе в виде утраты или изменении отдельных свойств бактерий.

Мутанты, нуждающиеся в определенных аминокислотах, азотистых основаниях, ростовых факторах, называются ауксотрофами. При биохимических мутациях происходит переход от прототрофного к ауксотрофному типу питания. Прототрофы могут расти на минимальной среде, т.к. они сами способны синтезировать нужные им для своего развития метаболитыаминокислоты, витамины, нуклеиновые кислоты и др., в то время как ауксотрофы нуждаются в определенных средах, содержащих необходимые для них метаболиты.

С целью выделения мутантных клеток может быть использован метод реплик. Для этого используют репликатор - печатку, который имеет диаметр почти такой же, как и чашка Петри (немного - на 0.5-1 см - меньше) (рис.1). Плоскость репликатора покрыта бархатом. Скачала к стерильному репликатору с бархатом прикладывают чашку с исследуемыми колониями, образовавшимися на полной среде. На ворсинках бархата остаются клетки всех колоний. К этой бархатной поверхности репликатора прикладывают две чашки- с минимальной и полной средой. Выросшие культуры с этих сред идентифицируют и устанавливают потребность в одном из метаболитов.

172

Рис. 1 – Метод реплик

По происхождению мутации условно делят наспонтанные и индуцированные. Первые возникают без вмешательства экспериментатора и составляют естественный (спонтанный) фон мутаций, величина которого колеблется в зависимости от типа мутации и вида микробной популяции. Вторые возникают в результате воздействия на бактериальную популяцию мутагенов– физических, химических или биологических факторов, способных вызвать мутацию. К мутагенам относятся различные виды радиации(ионизирующее излучение, УФ-лучи и др.), температура, большое число химических соединений(нитраты, нитриты, нитрозогуанидины, бромурацил, 2-аминопурин и др.).

Мутации подразделяют на прямые и обратные(если речь идет о направлении мутационного изменения). Мутации, возникающие в геноме "дикого типа" у бактерий в естественных условиях обитания, называются прямыми. Образовавшиеся особи являются мутантными. Мутации, завершающиеся возвратом от мутантного типа к дикому, называются реверсией. Особи, возникшие в результате обратных мутаций, называются ревертантами. Реверсии возникают под действием те же факторов окружающей среды, которые вызывают появление прямых мутаций. Реверсия может быть "истинной" в результате восстановления первоначального состояния мутантного гена: если она происходит за счет дополнительной мутации и восстановление происходит за счет исправления(восстановления) продукта мутировавшего гена на другом уровне, то такая мутация называется супрессорной.

Одной из форм мутации являетсядиссоциация (от лат. dissociаtio - расщепление) - возникновение в популяции микроорганизмов-вариантов, отличающихся от исходных родительских особей внешним видом и структурой колоний, так называемых S- и R-форм диссоциантов (от англ. smooth - гладкий, rough - шероховатый). S-формы колоний -круглые, влажные, с блестящей гладкой поверхностью, ровными краями. R-формы образуют колонии неправильной формы, непрозрачные, сухие с зазубренными краями и неровной шероховатой поверхно-

173

стью. Различному внешнему виду колоний соответствует ряд свойств. Чаще S- формы более вирулентны, клетки имеют нормальную морфологию, биохимически более активны, обычно выделяются востром периоде заболевания; у капсульных видов хорошо развиты капсулы, у подвижных видов имеются жгутики. Гладкие (S) и шероховатые (R) колонии являются крайними формами диссоциации, между которыми встречаются переходные формы (рис. 2).

-

Рис.2 - Изменение формы колоний в процессе диссоциации бактерий: S - гладкая, О - мутная (промежуточная), R - шероховатая

Диссоциация рассматривается как явление генетической природы, связанное с хромосомными мутациями генов, контролирующих синтез липополисахаридов клеточной стенки бактерий. Большинство микроорганизмов имеет полноценные свойства, находясь в S-форме.

2.2. Последовательность этапов работы по использованию мутагенеза

вгенетических экспериментах с бактериями

1.Определить, какой тип мутанта соответствует цели исследования.

2.Выбрать наиболее подходящий мутаген.

3.Создать условия для выражения(фенотипической экспрессии) новой

мутации.

4.Произвести обогащение по желаемому мутанту для повышения вероятности его выделения.

5.Обнаружить мутант соответствующими прямыми и непрямыми методами отбора.

6.Изучить свойства мутанта.

7.Определить расположение мутации в бактериальном геноме, т.е. картировать локус новой мутации.

Подробные методики выделения мутантов определенного типа могут значительно отличаться в зависимости от конкретных условий.

Выбор мутагена. В зависимости от целей мутагенеза используют химические или физические воздействия на бактериальную клетку мутагенами, способными вызвать изменения вгеноме, которые проявятся необходимым для экспериментатора фенотипом (табл.1).

Ультрафиолетовый свет. Облучение ультрафиолетом (УФоблучение) представляет собой один из простейших и самых удобных способов получения разнообразных бактериальных мутантов. Для этого пригодны практически любые источники ультрафиолетового света с длиной испускаемых волн около253,7 им. Следует лишь один раз откалибровать источник для получения оптимальной дозы облучения.

174

Методика

1.Выращивают культуру родительского бактериального штамма при 37°С

втечение 18-24 часов на плотной питательной среде.

2.С помощью бактериологической петли и оптического стандарта мутно-

сти получают разведение выращенной бактериальной культуры в физиологическом растворе, содержащее 108 микробных клеток в мл.

3.В течение 15-20 минут прогревают УФ-лампу. Полученное разведение бактериальной суспензии вносят по 5 мл в плоскодонные стерильные чашки Петри диаметром 100 мм, которые помещают под лампой (крышки при этом снимают). Покачиванием чашек обеспечивают равномерное облучение суспензии. Обычно используют ряд чашек с различной экспозицией под лампой(для определенного расстояния). Время облучения от чашки кчашке рекомендуется последовательно увеличивать в 2-10 раз (например, от 5 с до 5 мин). Тем самым будет оценено летальное действие УФ-облучения в зависимости от его дозы(продолжительности).

4.Немедленно после облучения делают несколько последовательных десятикратных разведений каждой из облученных суспензий с высевом цельной и разведенной культур на плотную питательную среду.

5.Инкубируют клетки в течение суток при37°С в затемненном помещении (в термостате или в термальной комнате с выключенным светом) для предупреждения фотореактивации.

6.Остаток каждой неразведенной облученной суспензии центрифугируют и осадок клеток ресуспендируют в бульоне (можно оставить в исходных цельных суспензиях, разлив каждую по нескольким пробиркам для получения независимых мутантных штаммов).

7.Через 1-2 суток учитывают число оставшихся после облучения жизнеспособных бактериальных клеток (по числу выросших колоний) и при необходимости строят калибровочную кривую доза УФ-облучения(экспозиция) - летальный эффект.

Поскольку УФ-облучение обладает относительно слабым мутагенным эффектом, то для получения удовлетворительного выхода мутаций обычно -ис пользуют дозу при норме выживания от 0.1 до 1%, соответственно при летальном

эффекте 99-99.9%.

Следует помнить, что в слишком концентрированных суспензиях(5·108 клеток/мл и более) при облучении имеет место эффект экранирования, обусловливающий снижение эффективности мутагенной обработки.

175

Таблица 1 - Свойства некоторых часто используемых мутагенов

176

177

Лабораторная работа № 5.2.

Методы изучения генетики микроорганизмов. Передача признаков методом скрещивания (конъюгации) бактерий. Плазмиды. Трансформация бактерий с помощью плазмидной ДНК

Передача генетической информации при трансформации и конъюгации бактерий. Перенос плазмиды RP4 при конъюгации. Трансформация бактерий с помощью хромосомной с ДНК, несущей детерминанту Strr

Цели занятия:

·познакомиться с основами техники передачи генетической информации при трансформации и конъюгации бактерий;

·осуществить перенос гена, кодирующего устойчивость к стрептомицину

(strr) при трансформации Е. coli M-17 нативной ДНК, выделенной по методу Мармура из Strr мутанта кишечной палочки(получение трансформанта Е. coli M17 Strr);

·осуществить перенос плазмиды RP4 от клеток бактерии-донора Е. coli K12 (RP4) в клетки реципиентного штамма Е. coli M17 Strr с помощью конъюгации на плотной среде (получение трансконьюганта Е. coli M17 Strr (RP4).

Материалы и оборудование

Лабораторная посуда и вспомогательное оборудование: стерильные чашки Петри с плотной питательной средой(агар «Д», FT-arap, эритрит-агар), пипетки, пробирки, флаконы, бактериологические петли, плотные питательные агаровые среды в чашках Петри, антибиотики (стрептомицин, канамицин), спиртовки, термостат, штативы с пробирками для приготовления разводок, микропипетки, позволяющие дозировать объем жидкости от 10 до 50 мкл.

Штаммы микроорганизмов:

Е. coli М-17;

Е. coli M17 Strr - мутант штамма Е. coli М-17, обладающий устойчивостью к 200 мкг/мл стрептомицина);

Е. coli K12 (RP4) - штамм кишечной палочки, несущий конъюгативную плазмиду RP4, детерминирующую устойчивость к тетрациклину(50 мкг/мл), канамицину (50 мкг/мл) и ампициллину (100 мкг/мл).

Ход работы

Подготовительный этап

Накануне лабораторной работы (в конце рабочего дня) подготовить чашки с плотной питательной средой и со средой, содержащей селективные препараты (Str - стрептомицин - 200 мкг/мл - для селекции трансформантов и комбинацию Str - 100 мкг/мл и Тс-тетрациклин - 50 мкг/мл); произвести посев культур Е. coli М-17, Е. coli M17 Strr; E. coli K12 (RP4) на полноценную плотную питательную среду (агар «Д», FT-arap, эритрит-агар) в пробирках или чашках Петри сплошным

178

газоном. Чашки и пробирки посеянной культурой помещают в термостат. Культуры выращивают в течение 16-20 часов при 37° С.

методика постановки трансформации

1. После достижения клетками логарифмической фазы(выращивание 1620 часов при 37°С) роста культуру отбирают бактериологической петлей со скошенного агара в пробирке или с плотной питательной среды в чашке Петри и суспендируют бактерии в пробирке с 2-5 мл охлажденного во льду буфера, имеюще-

го следующий состав: 75 мМ СаС12, 100 мМ MgCl2, 10 мМ CHsCOONa, pH 5,6. (В

зависимости от конкретного вида реципиента и типа используемой ДНК можно изменять концентрации: СаС12 в пределах от10 до 100 мМ и концентрацию MgCl2 от 50 до 200 мМ). Концентрация клеток в получаемой суспензии(1-5)·109. Оставляют суспензию на льду на 20 минут.

2.Вносят по 0,2 мл пробы компетентных клеток в охлажденные пластиковые пробирки Эппендорфа.

3.Добавляют к каждой пробе компетентных клеток по50 мкл хромосомной ДНК выделенной по методу Мармура.

4.Контроли: отдельно в пробирки Эппендорфа помещают 0,2 мл нативной ДНК (контроль№1) и отдельно исходную культуру без добавления ДНК(контроль №2)

5.Выдерживают смесь, содержащую ДНК и компетентные клетки, во льду

вхолодильнике при +4°С в течение 20 минут.

6.Подвергают смесь тепловому шоку при38±2°С в течение2,5 минут. Важна быстрая смена температуры; сама же температура шока и ее длительность различны в зависимости от свойств реципиентного штамма. Например, 2 минуты при 40°С или 1,5 минуты при 42°С могут оказаться более эффективными, чем 2,5 минуты при 38±2°С.

7.Если донорный маркер, по которому ведется отбор, обусловливает устойчивость к антибиотику(в особенности к бактерицидному, например Strr), смесь разводят 1:2 ростовой средой (бульоном) и инкубируют при 37°С в течение 60 минут для фенотипической экспрессии маркера устойчивости.

8.Высевают смесь на селективную среду, позволяющую отобрать трансформированные клетки (трансформанты), и в соответствующем разведении на неселективную среду для определения выживаемости и частоты трансформации(в пересчете на количество клеток реципиента). Так как обработка клеток СаС12 делает их непрочными, следует использовать свежеприготовленную, не сильно подсохшую среду.

9.Чашки инкубируют 2-3 суток при 37°С в термостате. После этого проводят подсчет транформантов, выросших на среде с селективным антибиотиком (Str 200 мкг/мл) и сравнивают с чашками, на которые высевали контроли: отдельно - 0,1 мл нативной ДНК (контроль№1) и отдельно - исходная культура без добавления ДНК (контроль №2).

179

Методика постановки скрещивания бактерий (конъюгации) на плотной питательной среде

(За сутки до лабораторной работы)

1.Чашку Петри с полноценной питательной средой условно разделить на три сектора (разделение провести карандашом по стеклу и обозначить сектора: 1) D, 2) R, 3) D+R.

2.Для высева приготовить рабочее разведение физиологическим раствором до концентрации 1·109 микробных клеток в1 мл (по оптическому стандарту

мутности) бульонных (или агаровых) культуры штаммов Е. coli K12 (RP4) и Е. coli Ml7 Strr, находящиеся в экспоненциальной фазе роста(посев которых производится накануне - за 16-20 часов до основного эксперимента).

3.На поверхность питательной среды первого сектора(с условным обозначением D) микропипеткой аккуратно наносят каплю(50 мкл) культуры штам- ма-донора Е. coli K12 (RP4), несущего плазмиду RP4; на поверхность питательной среды второго сектора (с условным обозначением R) микропипеткой наносят каплю (50 мкл) культуры реципиентного штамма Е. coli M17 Strr; на поверхность питательной среды третьего сектора(с условным обозначением D+R) микропипет-

кой наносят по капле(по 25 мкл) культур реципиента и донора(штаммы Е. coli K12 (RP4) и Е. coli Ml7 Strr), чтобы у них была зона совместного (сливного) роста.

4.Чашки не переворачивая, помещают в термостат и инкубируют при37°

втечение 24 часов.

(В день лабораторной работы)

5.Через сутки из центров газонов культур: 1) D, 2) R, 3) D+R, выросших в виде трех пятен, отбирают стерильной бактериальной петлей выросшие культуры

исуспендируют каждую в отдельной пробирке с2 мл физиологического раствора до концентрации ~1-3·109 микробных клеток в 1 мл. Полученные суспензии по 50 мкл высевают на элективную питательную среду в чашках Петри, содержащую антибактериальные препараты для селекции(отбора трансконъюгантов Тс50 мкг/мл) и контрселекции (подавления роста клеток донораStr - 100 мкг/мл) . Чашки инкубируют при 37°С в течение 48 часов.

6.Если через двое суток на среде, где была посеяна смесь донора и реципиента (D+R), имеется рост культуры, а контрольные чашки чистые (отсутствует рост донора и реципиента, посеянных отдельно), то конъюгация прошла успешно,

аполученная культура несет детерминанты устойчивости присущие реципиенту Е. coli M17 Strr с плазмидой RP4, т.е. получен трансконъюгант Е. coli M 17 Strr

(RP4).

180

6.МИКРООРГАНИЗМЫ КАК БИОГЕОХИМИЧЕСКИЕ ОБЪЕКТЫ

1.Участие микроорганизмов в превращении веществ и энергии в биосфере

(биогеохимические циклы превращения веществ) Микроорганизмы принимают активное участие в биогеохимических цик-

лах превращения веществ в биосфере. Глобальное значение имеет деятельность микроорганизмов в циклах углерода, азота и серы. Процесс круговорота углерода состоит из синтеза и минерализации органических веществ. Ежегодно накапливаемое органическое вещество в процессе фотосинтезирующей деятельности, главным образом, растений и водорослей, перерабатывается на разных уровнях жизни консументами и деструкторами. К первым принадлежат, в основном, животные, ко вторым – грибы и бактерии. Последовательность этих событий выражается в трофических цепях или цепях питания. Конечное, деструктивное, звено этой цепи – минерализация органических веществ с возвратом СО2 в атмосферу – осуществляется гетеротрофными микроорганизмами.

Первыми деструкторами природных биополимеров(белков, нуклеиновых кислот, гемицеллюлозы, пектина, крахмала, целлюлозы, лигнина и др.) могут выступать лишь те микроорганизмы, которые синтезируют гидролитические ферменты. В аэробной зоне к таким микроорганизмам относятся грибы, некоторые, главным образом, грамположительные бактерии, в том числе и актиномицеты. В анаэробной зоне – это только бактерии, в основном из группы клостридий. В аэробной зоне происходит практически полное превращение полимеров с освобождением СО2. В анаэробных условиях в процессе первичного разложения органических веществ в качестве продуктов распада образуются жирные кислоты, спирты и молекулярный водород, которые частично используются вторичными анаэробами, например, сульфатредуцирующими и денитрифицирующими бактериями в качестве источника углерода при восстановлении неорганических акцепторов электрона или метанобразующими бактериями в процессе карбонатного дыхания.

Азот - один из главных биогенных элементоввходит в состав основных полимеров любой живой клетки(структурных белков, белков – ферментов, нуклеиновых и аденозинфосфорных кислот). Большие запасы азота на планете представлены его восстановленными и окисленными газообразными формами(N2, NH3, N2O, NO, NO2), которые входят в состав атмосферы Земли. Молекулярный азот составляет 78,09% (по объему) атмосферных газов. Главными агентами круговорота азота в природе выступают микроорганизмы(рисунок 1). Азот в этом цикле участвует в газообразной форме, в виде минеральных и органических соединений. При фиксации азота микроорганизмами происходит его восстановление; при разложении органических азотсодержащих соединений(аммонификация) азот освобождается в форме аммиака, который далее окисляется последовательно до нитритов и нитратов(нитрификация). Окисленный азот вновь восстанавливается до N2 в процессе денитрификации. Аммонийные и нитратные формы азота ассимилируются растениями в виде органических веществ.