Микробиология

151

водный кран протирают тампоном, смоченным спиртом, или обжигают, после чего 10-15 минут спускают воду и затем набирают в склянки и закрывают их пробками и колпачками. При проведении анализа хлорированной воды в сосуды вместимостью 500 мл перед стерилизацией вносят дехлоратор10 мг гипосульфита натрия. Отобранные пробы хранят при температуре не выше+4°С и не более2 часов. Для хранения проб в течение более длительного времени используют температуру +2°С.

Определения микробного числа. Согласно требованиям ГОСТ 18963-73

определяют содержание в1 мл исследуемой воды мезофильных аэробов и факультативных анаэробов, способных при 37°С в течение суток на МПА образовывать колонии, видимые невооруженным глазом или при увеличении в2-5 раз. Из каждой пробы делают посев не менее двух различных объемов(разведений), выбранных с таким расчетом, чтобы число выросших на чашках колоний колебалось в пределах от30 до 300. При исследовании водопроводной воды в каждую из двух чашек вносят по0.1-0.2 мл (до 1.0). При исследовании более загрязненных вод берут для посева по 0.1 мл последовательных десятикратных разведений, используя для каждого разведения отдельную стерильную пипетку.

Определение бактерий группы кишечной палочки. При исследовании обсемененности воды к бактериям группы кишечной палочки относятся грамотрицательные неспоровые палочки, сбраживающие лактозу при 37°С с образованием кислоты и газа в течение1-2 суток или сбраживающие глюкозу в течение суток и не обладающие оксидазной активностью.

Исследование на наличие бактерий группы кишечной палочки обычно проводят одним из двух общепринятых методов - методом мембранных фильтров или двухэтапным бродильным методом.

Метод мембранных фильтров используют для анализа водопроводной воды или воды артезианских колодцев. Фильтр № 3 помещают в горячую воду (50-60°С) и кипятят три раза по15 минут, сменяя каждый раз воду. Фильтр помещают в простерилизованный аппарат Зейтца и фильтруют через него исследуемую воду. Количество фильтруемой воды - 300-500 мл в зависимости от ее чистоты. После фильтрации фильтр переносят стерильным пинцетом на чашку Петри со средой Эндо. Чашку помещают на сутки в термостат с температурой 37°С, спустя сутки просматривают выросшие колонии. Кишечная палочка дает на среде Эндо характерные колонии с металлическим блеском, вокруг которых среда краснее вследствие образования кислоты. Из нескольких колоний делают мазки и красят их по Граму. Кишечная палочка грамотрицательна. Для окончательного заключения колонии пересевают на среду Эйкмана в пробирки, которые помещают на сутки в термостат с температурой37°С. Кишечная палочка на этой среде дает помутнение и бурно выделяет газ.

Наибольшее распространение в практике санитарной службы имееттит-

рационный (двухэтапный бродильный) метод, который позволяет получать

152

более точные и стабильные результаты. Этим методом определяют размножение бактерий группы кишечной палочки при посевах различных объемов исследуемой жидкости. В качестве среды накопления используют лактозо-пептонную среду с индикатором и бродильными трубками или глюкозо-пептонную среду (среда Эйкмана) и розоловый дифференциальный агар(РДА). Анализ воды проводят в двух и трех параллельных рядах, начиная десятикратных разведений вплоть до 10-7 при исследовании особенно загрязненных вод. Для объемов 100, 10 мл воды используют флаконы с 10 мл и пробирки с 1 мл лактозо-пептонной концентрированной (или глюкозо-пептонной) среды. Все остальные объемы вносят в пробирки с 5 мл разведенной питательной среды. Культивирование посевов производят при 37°С в течение суток. Отсутствие изменений в посевах (помутнение пробы, образование кислоты или газа) позволяет уже на этом этапе закончить исследование и дать отрицательный ответ. При наличии кислоты, газа и помутнения из такого флакона производят посев секторами со средой Эндо ,такчтобы получить изолированные колонии. Если через 16-18 часов инкубации при 37°С на среде выросли темно-красные с металлическим блеском или без него колонии, то из этих колоний делают мазки, проводят пробу на оксидазу. Розовые, пленчатые, бесцветные и других типов колонии на среде не учитывают. Обнаружение в мазках грамотрицательных палочек и отсутствие оксидазы свидетельствует о наличии в исследуемой воде кишечной палочки. Результаты исследований выражают в виде коли-индекса, т.е. количества кишечных палочек в 1 л воды. Расчет колииндекса проводят по таблицам ГОСТ18963-73 (таблица 1) для трехрядового параллельного исследования или Хоскинса-Мура (таблица 2) для двухрядового исследования воды.

Таблица 1 - Определение коли-индекса при исследовании 300 мл волы по ГОСТ 18963-73

153

Для исследования воды открытых водоемов, а также колодцев пробы воды в стерильную посуду(флаконы, бутылки и др.) отбирают с помощью батометров различной конструкции на глубине 10-20 см от поверхности. При выборе источников централизованного водоснабжения исследования поверхности водоемов проводят на расстоянии 1 км вверх по течению, а на непроточных водоемах и водохранилищах - на расстоянии 1 км по обе стороны от места водозабора. Пробы отбирают ежемесячно из расчета не менее 12 проб в год.

Таблица 2 - Определение коли-индексов при двухрядовом титровании по Хоскинсу-Муру

154

Микробиологический контроль биотехнологических процессов, рабочих поверхностей и продуктов

Биотехнологические процессы, как правило, проводят в асептических условиях, т.е. условиях, когда предусматривается проведение комплекса мероприятий, направленных на предотвращение попадания в среду(рабочие аппараты, культиваторы, инструментарий) посторонних микроорганизмов (в отличие от асептики в медицине, когда не допускается возможность попадания всех контаминантов на операционное поле или в рану).

Комплекс мер, обеспечивающих асептику биотехнологических процессов включает: механическую, физическую и химическую защиту биообъекта и среды его обитания, а при необходимости - и конечный продукт.

В производственных условиях источниками микробов-контаминантов могут быть почва, вода, окружающий воздух, люди.

По степени загрязненности воздуха микробами и механическими частицами в расчете на 1 м3 производственные помещения, в которых асептично изготавливают МИБП и лекарственные средства, классифицируют по классам опасности следующим образом:

-1-й класс чистоты с ламинарным потоком стерильного воздухадля изготовления стерильных медицинских препаратовне должно быть микробов, а механических частиц размером до 0.5 мкм - не более 3500;

-2-й класс чистоты - до 50 микробных клеток, до 2500 частиц размером 5 мкм и до 350000 частиц размером 0.5 мкм;

-3-й класс чистоты - до 100 микробных клеток (ЗА класс - до 200, 3Б класс - до 500 клеток);

-4-й класс чистоты - по ГОСТ 12.1.005-85.

155

Для помещений 2-го и 3-го классов чистоты, в которых изготавливают нестерильные лекарственные средства, нормирование воздуха по содержанию механических частиц не предусматривается.

Лекарственные средства по "микробной чистоте" разделяют на 4 катего-

рии:

1 - стерильные препараты для инъекций, приготовленные на апирогенной

воде;

2 - глазные лекарства, препараты для введения в различные полости тела, средства для лечения ран и обширных ожогов также не должны содержать живых микроорганизмов;

3 - лекарственные препараты для наружного применения не должны содержать более 100 живых микробных клеток в1 г (мл) препарата при безусловном отсутствии в них бактерий, относящихся к семействуEnterobacteriaceae,a

также Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus;

4 - все прочие лекарственные средства должны содержать 1в г (мл) не более 1000 жизнеспособных клеток сапрофитов и не более 100 клеток непатогенных грибов при отсутствии болезнетворных и условно-патогенных микроорганизмов, включая энтеробактерии, Р.аеruginosa, S.aureus, аспорогенные дрожжи рода Candida. Контроль обсемененности помещений биотехнологических производств проводят путем взятия проб воздуха и смывов с рабочих поверхностей в аппаратных залах и помещениях лабораторий.

В зависимости от цели проводимого исследования и характера контролируемого объекта в полученных смывах определяют:

-общую обсемененность в пересчете на 1 см2 исследуемой поверхности;

-наличие бактерий группы кишечной палочки как показателей фекального загрязнения, свидетельствующих о нарушении санитарного режима;

-наличие патогенных бактерий кишечной группы, обнаружение которых является безусловным показателем эпидемического неблагополучия;

-наличие синегнойной палочки, стафилококков и других микроорганиз-

мов.

Для получения смывов пользуются стерильными ватными тампонами или марлевыми салфетками. В день взятия смыва в каждую пробирку с тампоном наливают по 2 мл стерильной водопроводной воды или изотонического раствора хлорида натрия так, чтобы ватный тампон находился над уровнем жидкости.

Марлевые салфетки размером 5x5 см завертывают по одной в бумажные пакеты и стерилизуют в сухожаровом шкафу. К каждой салфетке заранее готовят пробирку с 2 мл стерильной воды для смачивания. Непосредственно перед взятием смыва пробирку наклоняют, увлажняя находящийся в ней тампон. В случае применения салфеток их захватывают кончиком стерильного пинцета, прокаленного над пламенем горелки, и увлажняют стерильной водой из пробирки.

Увлажненный водой тампон или салфетку дают в руки исследуемому, предлагая протереть им кожу левой, а затем правой руки в такой последовательности (от участков с меньшей загрязненностью к участкам более загрязненным): тыл кисти, ладонную поверхность, межпальцевые пространства, ногтевые ложа.

156

По окончании процедуры салфетки или тампоны помещают впробирку, в которой они находились.

При взятии смывов с предметов, имеющих большую поверхность, исследуемый участок ограничивают рамкойтрафаретом площадью 25, 50 или 100 см2. Трафарет, изготовленный из проволоки, после каждого смыва и перед употреблением прожигают над пламенем горелки. При исследовании мелких предметов смыв делают со всей поверхности.

Для определения общего числа микробов в исследуемом смыве к 2 мл воды, которая была использована для увлажнения тампонов, прибавляют еще 8 мл воды. Тампон тщательно промывают в течение 2 минут, получая исходное разведение. Из него готовят ряд последовательных десятикратных разведений, которые высевают по 0,1 мл на МПА в чашки Петри. Посевы выдерживают 24 часа при 37°С и 24 часа при комнатной температуре, после чего производят подсчет выросших колоний. Затем рассчитывают количество микробов на1 см2 исследуемой поверхности. Для выявления бактерий группы кишечной палочки можно пользоваться прямым посевом исследуемого материала на чашки со средой Эндо, Левина, Плоскирева, мелочно-солевой агар Петрович.

Исходным материалом для посева продуктов плотной консистенции обычно является 10%-ная взвесь продукта. Для ее приготовления стерильно взятую из разных мест пробы навеску(обычно 15 г) измельчают в гомогенизаторе или измельчают в стерильной ступке, прибавляют 135 мл стерильной водопроводной воды или изотонического раствора хлорида натрия. Жидкий продукт или полученную смесь плотного продукта используют для приготовления ряда десятикратных разведений в зависимости от характера продукта и от предполагаемого обсеменения кишечными палочками и сапрофитной флорой.

Общую обсемененность или общее количество бактерий в1 г (мл) продукта учитывают по росту мезофильных микроорганизмов на мясо-пептонном агаре. Разведение выбирают с таким расчетом, чтобы на чашке вырастало 50-300 колоний. Чашку инкубируют при 37°С в течение 2 суток. По материалам Института питания АМН РФ в 1 г (мл) пищевых продуктов, обычно содержится 103-104 бактерий. Пища, содержащая 106-107 бактерий в 1 г (мл), потенциально опасна для здоровья и может вызвать пищевые отравления.

3. Техника безопасности

При проведении практического занятия по определению обсемененности воздуха, воды, рабочих поверхностей и микробиологического контроля биотехнологических процессов и продуктов необходимо неукоснительно соблюдать правила, обязательные при работе с лабораторной стеклянной посудой, электрооборудованием; газовыми горелками и сосудами, работающими под давлением.

4.Вопросы по теме занятия

1.Какими вопросами занимаются санитарная микробиология и экологическая микробиология?

2.Какие микроорганизмы относятся к санитарно-показательным и с какойцелью их определяют?

157

3.Что такое коли-титр и коли-индекс?

4.Какие методы используют для анализа микрофлоры воздуха?

5.Расскажите о седиментационном методе бактериологического исследования воздуха.

6.В каких условиях проведения седиментационного анализа воздуха можно использовать пересчет по Омельянскому?

7.Расскажите о принципах работы приборов Кротова, Дьяконова, ПАБ-1.

8.Расскажите о принципах работы многокаскадного импактора Мея.

9.Какие зоны сапробности по наличию в них микроорганизмов различают в водоемах?

10.Как проводят отбор проб воды из водопроводной системы и из другихис точников?

11.Как проводится микробиологический анализ воды с помощью мембранных фильтров и аппарата Вейтца?

12.Какие этапы исследований предусматривает титрационный метод определения микробного загрязнения воды?

13.Как классифицируют помещения по степени микробиологической чистоты при производстве МИБП и лекарственных средств?

14.Как классифицируют лекарственные средства по "микробной чистоте"?

15. Как проводится контроль обсемененности микробиологических -произ водств?

16.Каким методом определяется обсемененность биотехнологической аппаратуры и рабочих поверхностей?

17.Какими методами анализируется обсемененность продуктов плотной и жидкой консистенции?

5.Литература по теме занятия

1.Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. М.О.Биргера.—М., Медицина, 1982.

2.Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. - М., Медицина, 1973.

3.Блинов Н.П. Основы биотехнологии. - Санкт-Петербург, Наука, 1995.

4.Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / Под ред. проф. Л.Б.Борисова и проф. А.М.Смирновой. - М., Медицина, 1994.

158

Лабораторная работа № 4.3.

Изучение влияния физических факторов на микроорганизмы (температура, ультрафиолетовые лучи)

1. Общие сведения

Развитие и жизнедеятельность каждого вида микроорганизмов могут происходить только в определенных пределах температуры. Наименьшая температура, при которой наблюдается развитие микроорганизмов, хотя и очень слабое, называется минимальной. Ниже этой температуры развитие прекращается, но микроорганизмы более или менее длительно могут сохраняться живыми. Наибольшая температура, при которой еще наблюдается слабое развитие микроорганизмов, называется максимальной. Даже при незначительном повышении максимальной температуры развитие микроорганизмов прекращается и они быстро гибнут. Температура, при которой развитие микроорганизмов происходит наиболее интенсивно, называется оптимальной. Отношение микроорганизмов к температуре, превышающей максимальную, или термоустойчивость микроорганизмов, различно. Бесспоровые бактерии, вегетативные клетки споровых бактерий, дрожжей и плесеней при температуре 50 – 70 0С погибают в течение 15 – 30 мин, а при 80 – 100 0С – в течение нескольких минут или секунд. Споры большинства дрожжей и плесеней погибают при 65 – 80 0С. Споры бактерий значительно более термостойки. Некоторые из них выдерживают нагревание при100 0С в течение нескольких часов и относительно быстро погибают лишь при 120 – 130 0С.

Устойчивость микроорганизмов к губительному действию Уф-лучей раз-

лична.

Эффективность воздействия Уф – лучей определяется как устойчивостью микроорганизмов, так и дозой облучения. Доза облучения зависит от мощности источника Уф – лучей, от расстояния между ним и облучаемыми микроорганизмами и от продолжительности облучения.

Уф – лучи имеют слабую проникающую способность, поэтому эффективность облучения микроорганизмов зависит еще и от свойств среды в которой они находятся.

Источником коротковолновых Уф – лучей (длина волны около 260 нм), обладающих наибольшим бактерицидным действием, в настоящее время служат бактерицидные лампы (БУВ – 15 и др.).

2. Содержание лабораторного занятия

Цели занятия

-Изучить интенсивность роста бактерий при температурных условиях:

при 4, 25 и 37 0С.

-Определить эффективность действия Уф – лучей на исследуемые бакте-

рии.

159

Материалы и оборудование

1.Культура микроорганизмов в пробирках (E. coli М-17).

2.Жидкие и плотные питательные среды(эритрит – агар, 2%-й раствор пептона).

3.Стандарты мутности со шрифтовыми таблицами.

4.Бактериологические петли, спиртовки, пипетки, шпатели, штатив для пробирок на 20 гнезд.

5.Стерильные пробирки, чашки Петри, чашки Петри с плотной питательной средой.

6.Разводящий буферный или физиологический растворы.

7.Холодильник бытовой шкафного типа.

8.Термостат.

9.Бактерицидные лампы (БУВ – 15) или аналогичные.

План занятия

1.Введение – 5 мин.

2.Контроль исходного уровня знаний – 10 мин.

3.Собеседование и коррекция знаний – 25 мин.

4.Самостоятельная работа – 75 мин.

5.Подведение итогов занятия – 5 мин.

6.Сбор отчетов для проверки преподавателем – 5 мин.

Ход работы

Работа 1. Изучение интенсивности роста бактерий(E. coli М-17) на жидкой и плотной питательных средах в различных температурных условиях: при 4,

25и 37 0С.

1.Расплавить питательный агар, разлить в чашки Петри, жидкую питательную среду (эритрит – агар, 2% - й раствор пептона) разлить в пробирки по 4,5 мл.

Промаркировать чашки Петри и пробирки с указанием температуры опыта, фамилии студента и номера группы.

2.Осуществить посев приготовленных бактериальных культур на плотную и жидкую питательные среды. Оптическая концентрация посевных культур по стандарту мутности ГИСК должна соответствовать одному млрд. кл. / мл.

3.Засеянные чашки перевернуть кверху дном. Поставить выращивать посевы на жидкой и плотной питательных средах при температуре 4, 25 и 37 0С.

4.По истечение 48 часов произвести просмотр чашек и пробирок с культурами бактерий. Во всех варианта опыта выявить отсутствие или наличие роста, а также его интенсивность. При оценке роста пользоваться условными обозначениями: - отсутствие роста; + - слабый рост; ++ - умеренный рост; +++ - обильный рост.

160

Работа 2. Определение эффективности действия Уф – лучей на исследуемые бактерии (E. coli М-17).

1.Расплавить питательный агар, разлить в чашки Петри. Промаркировать три чашки с питательной средой, предназначенные для посева в них облученной микробной суспензии с указанием величины расстояния от облучателя и времени облучения, фамилии студента и номера группы.

2.Определение числа живых клеток в опытной суспензии с различной степенью удаления от облучателя производить методом счета колоний.

3.В три чашки Петри внести по5 см3 опытной суспензии (концентрация микробов 1 млрд. кл./мл) после тщательного перемешивания ее и производить облучение на различном удалении от источника: 1 см, 25см и 50 см. Поочередно подставить чашки под бактерицидную лампу на указанные высоты и держать их открытыми в течение: 20, 40, 60, 80, 100, 120 секунд. Посеять контрольную чашку без облучения Уф– лучами. Время замерять секундомером. С целью предохранения глаз от Уф – лучей следует надевать светозащитные очки или покидать лабораторию на время облучения.

4.Сделать посевы облученных суспензий по0,1 см3 их (после перемешивания) в соответствующие чашки Петри.

5.Чашки с засеянной средой поставить в термостат при температуре37 0С

на 48 – и часовое инкубирование.

6. После завершения культивирования необходимо просчитать колонии на всех чашках. Вычислить количество клеток на различном удалении от облучателя и выразить его в процентах исходного числа живых клеток в опытной суспензии. При этом учесть разведение необлученной суспензии, сделанное перед ее высевом.

Материалы, представляемые в отчет по лабораторной работе

1.Описать последовательность проведения работ.

2.Результаты исследований работы 1 записать по форме: