Микробиология

121

жая петлю с исследуемой культурой в глубь питательной среды до дна пробирки. Пробирки, в которые посеяны культуры микробов, способных расти при 20-25°С, оставляют при комнатной температуре. Остальные посевы инкубируют в термостате при 37°С. Вместе с опытными пробирками в термостат ставят одну иди две пробирки с незасеянной желатиной для контроля. При температуре 37°С желатина плавится, поэтому после инкубации пробирки, вынутые из термостата, опускают в холодную воду или ставят в холодильник. После застывания желатины в контрольных пробирках приступают к просмотру роста и учету изменений в питательной среде опытных пробирок. Там, где под действием фермента желатиназы произошло расщепление белков желатины, отмечается визуальное разжижение питательной среды. Если желатина разжижается, указывают интенсивность и форму разжижения - послойное, воронкообразное, мешковидное и т.д. (рис.4).

Рис.4 - Схема разжижения желатины микроорганизмами при посеве уколом: 1 - кратеровидное, 2 - реповидное, 3 – воронкообразное, 4 - мешковидное, 5 - послойное, 6 – пузыревидное; 1-3 и 5 – разжижение вызвано аэробами, 4 - факультативными анаэробами, 6 - анаэробами облигатными

Пробирки, в которых после суточного инкубирования среда остается без изменений, оставляют в термостате. Наблюдения за изменением среды ведется в течение 10 суток. В протоколе исследования обязательно отмечают день проявления признаков разжижения среды, степень и характер разжижения.

Протеолиз казеина на молочном агаре Эйкмана. Для выявления этой способности к 10 мл стерильного расплавленного на водяной бане - мясо пептонного агара добавляют, соблюдая правила асептики, 2.5-3 мл снятого стерильного молока. Перед приготовлением среды молоко обезжиривают центрифугированием в течение 15 минут при 2000-3000 об/мин с удалением толстой поверхностной пленки и стерилизуют при0.5 ати в течение 20 минут. Полученную среду разливают в чашки Петри. Среду используют без дополнительной стерилизации, т.к. совместная стерилизация молока с агаром неприменима вследствие свертывания казеина с образованием хлопьев. Бактерии высевают штрихом по диаметру чашки или уколом. Продолжительность культивирования 2-10 суток. Гидролиз казеина обнаруживают по зоне просветления среды вокруг колоний или выросших по штриху микроорганизмов. Особенно четко она видна после обработки среды раствором 5%-ной трихлоруксусной кислоты. Зону гидролиза казеина измеряют в мм от края штриха или колонии до границы светлой зоны. Чем больше диаметр светлой зоны, тем выше казеинолитическая активность бактерий.

122

Протеолиз куриного яичного белка. В пробирку со стерильным мясо-

пептонным бульоном нейтральной реакции прибавляют, соблюдая правила асептики, кусочки вареного яичного белка в форме кубиков с гранями5-8 мм, Предварительно белок куриного яйца нарезают в стерильной посуде и стерилизуютв течение 20 минут при 1200С. С помощью бактериологической петли в пробирку вносят культуру микроорганизма. Посевы просматривают ежедневно в течение 5 дней. Протеолитически активные культуры расщепляют коагулированный яичный белок: кусочки белка, содержавшиеся в среде, заметно уменьшаются в размере, превращаясь в крошкообразную массу, или полностью растворяются.

Некоторые микроорганизмы с выраженной протеолитической активностью обладают способностью расщеплять белок и пептон до продуктов глубокого распада: индола, сероводорода, аммиака.

Обнаружение аммиака. Способность микроорганизмов образовывать аммиак выявляют при их росте в мясо-пептонном бульоне. Для этого МПБ разливают в пробирки по 5-8 мл в каждую и стерилизуют при1 ати. После посева под ватно-марлевой пробкой укрепляют узкую стерильную полоску лакмусовой -бу маги так, чтобы она не соприкасалась с питательной средой. Пробку рекомендуется заворачивать целлофаном, чтобы затруднить улетучивание аммиака. При образовании аммиака красный лакмус синеет,

Обнаружение сероводорода. Выявление способности продуцировать сероводород, основано на реакции образования сульфидов металлов. Наиболее распространенный способ - проба с уксуснокислым свинцом. Микроорганизмы выращивают в МПБ, содержащем и 0.01% цистина и цистеина, или в бульоне Хоттингера. Тотчас после посева исследуемых микроорганизмов В пробирку вносят и размещают под средой полоску фильтровальной бумаги, пропитанную насыщенным раствором уксуснокислого свинца, укрепив ее под ватно-марлевой пробкой

(рис.5).

Рис. 5 - Обнаружение сероводорода, образуемого микроорганизмами: 1 - почернение индикаторной бумаги с уксуснокислым свинцом,

2 - образование сульфида железа FeS в толще среды

Пробку пробирки заворачивает в целлофан, чтобы затруднить улетучивание сероводорода. Продолжительность культивирования 7-10 суток. В положительных случаях образующийся в культуре сероводород вступает с бесцветным

124

Факультативные анаэробы достаточно хорошо растут и в аэробных, и в анаэробных условиях. В анаэробных условиях многие из них способны использовать в качестве конечного акцептора электронов не кислород, а нитраты. В ходе этого процесса, называемого денитрификацией, или нитритным дыханием, нитраты восстанавливаются до нитритов и далее до газообразного азота. Другие факультативные анаэробы могут в анаэробных условиях переключаться с дыхания на брожение, и тогда в средах с углеводами накапливаются значительные количества органических кислот.

Способность к денитрификации определяют на среде следующего состава

(г/л): глицерин - 10.0, дрожжевой экстракт - 5.0, (NH4)2SO4 - 2.0, KNO3 – 10.0, К2НРO4- 2.0, MgSО4×7H2O - 0,025, NaCl - 0.5, FеSO4×7Н2О - 0.001, агар - 1.0, Сре-

ду разливают в пробирки по5 и 10 мл и стерилизуют при0.5 ати. Исследуемую культуру вначале сеют в пробирки 5с мл среды (1-ый пассаж). Посев делают уколом. Через 24 часа петлю культуры 1-го пассажа переносят в пробирки с10 мл среды, которую предварительно расплавляют и охлаждают до40-45°С. После внесения бактерий среду перемешивают, остужают и заливают 2-3 мл стерильного 1%-ного водного агара для создания анаэробных условий. Развитие бактерий, способных к денитрификации, сопровождается помутнением среды и выделением газа. Проверить способность бактерий к восстановлению нитратов можно и на МПБ, к которому добавляют 0.2% KNO3. Среду разливают в пробирки, опускает на дно каждой поплавок и стерилизуют при1 ати. Посев проводят суспензией клеток. Продолжительность культивирования - 2-5 суток. По окончании опыта отмечают накопление в поплавке газа(N2) и определяют качественными реакциями присутствие в культуральной жидкости нитратов и нитритов.

Реакция на нитраты с дифениламином. На фарфоровую пластинку переносят каплю концентрированной серной кислоты, помещают в нее несколько кристаллов дифениламина и после его растворения добавляют каплю исследуемой жидкости. При наличии ионов NO3- жидкость окрашивается в темно-синий цвет. Следует иметь в виду, что азотистая кислота также дает с дифениламином синее окрашивание. Поэтому пробу на нитраты можно проводить только при отсутствии в среде нитритов.

Крахмал-йодная реакция на нитриты. Реакция основана на том, что нит-

риты в кислой среде окисляют йодистый цинк с выделением йода, присутствие которого хорошо обнаруживают крахмалом. Для проведения реакции к капле культуральной жидкости добавляют каплю раствора, содержащего на 100 Н2О ZnCl2 - 2.0 г, Kl - 0.4 г, крахмал - 0.4 г, каплю 20%-ного раствора НСl. При наличие в среде нитритов появляется синее окрашивание.

Реакция на нитриты с реактивом Грисса. Реакция основана на образова-

нии в кислой среде в присутствии нитритов и ароматических аминов(сульфофеноловой кислоты и α-нафтиламина) азосоединения, окрашенного в краснорозовый цвет. Реактив Грисса готовят ex tempore, смешивая равные объемы заранее приготовленных растворов 1 и 2.

Раствор 1. 0.5 г сульфаниловой кислоты растворяют в30 мл ледяной уксусной кислоты. Добавляют 100 мл дистиллированной воды и фильтруют. Раствор устойчив в течение месяца.

126

Для этого на поверхность среды наливают 3-5 мл раствора Люголя. Среда, содержащая крахмал, окрашивается в синий цвет, а зона гидролиза остается бесцветной или приобретает красно-бурую окраску, если крахмал гидролизовался до декстринов. Зону гидролиза крахмала измеряют до границы светлой зоны. Чем больше размер светлой зоны, тем выше амилолитическая активность (рис.7).

Липолитическая активность. Липиды подвергаются гидролитическому разложению под действием липаз. Продуценты липаз обнаруживаются среди дрожжей, мицелиальных грибов, бактерий рода Clostridium и других групп микроорганизмов. Для выявления липолитической активности исследуемые микроорганизмы высевают на среду, содержащую соответствующий липид. Определенная трудность при постановке таких опытов связана с тем, что жиры не смешиваются с водой. Поэтому чаще всего вместо жиров в среду вводят твиныэфиры жирных кислот и сорбита. Твин-40 содержит пальмитиновую, твин-60 - стеариновую, а твин-80 - олеиновую кислоты. Твины хорошо растворимы в воде и имеют нейтральную реакцию. Состав среды (г/л): твин - 10.0, пептон -10.0, NaCl - 5.0, CaCl2×2H2О - 0.1, агар - 20.0, рН среды - 7.4. Готовят среду без твина и стерилизуют ее при 1 ати. Водный раствор твина соответствующей концентрации стерилизуют отдельно при0.5 ати и добавляют к стерильной основной среде. Среду разливают в чашки Петри. Когда агар застынет, на поверхность агаровой пластинки высевают штрихом или уколом исследуемый микроорганизм. Засеянные чашки Петри выдерживают при соответствующей температуре необходимое для роста микроорганизма время. На наличие липазы указывает образование вокруг штриха или колонии непрозрачной зоны кальциевых солей жирных кислот, освобожденных от твина.

2.4. Определение вида бактерий по Ленису

Для описания физиологических и биохимических признаков определяемый микроорганизм из чистой культуры, соблюдая стерильность, засевают в 6 пробирок с диагностическими питательными средами: 1 - МПБ, 2 - прямой, 3 - МПА скошенный, 4 – МПЖ, 5 - молоко, 6 - косяки картофеля. В пробирки 2 и 4 микроорганизмы пересевают уколом, а остальные – петлей. Посевы помещают в термостат при температуре 25-28°C, исключая пробирку с МПЖ (4), которую оставляют при комнатной температуре (не выше 24°С).

Через 2-5 суток приступают к определению рода и вида изучаемых бактерий, пользуясь определителем или таблицей, пригодной для определения бактерии из воздушной среды. Ниже в качестве примера приводится схема определения форм бактерий (сокращенно по Ленису).

127

Лабораторная работа № 3.2.

Правила работы с бактериофагами. Качественные пробы для обнаружения бактериофагов. Определение титра бактериофагов

Цель занятия:

·познакомиться с правилами работы с бактериофагами и техникой обнаружения бактериофагов в жидкой питательной среде по Уварову и на плотной питательной среде с помощью методов Отто и Грациа;

·оценить концентрацию (титр) бактериофага в исследуемом материале по методу Аппельмана.

Материалы и оборудование

Лабораторная посуда и вспомогательное оборудование: стерильные чашки Петри, пипетки, пробирки, флаконы, бактериальные петли, плотные питательные агаровые среды в чашках Петри, питательный бульон, спиртовки, термостат, штативы для пробирками для приготовления разводок, микропипетки, позволяющие дозировать объем жидкости до 50 мкл.

Культуры микроорганизмов: Е. coli М-17, вирулентный бактериофаг Е.

coli.

Ход работы

Обнаружение бактериофага из исследуемого материала с использованием жидкой питательной среды (по Уварову)

1.Приготовить по 5 мл стандартной жидкой культуры Е. coli М-17, содержащей 1·109 микробных клеток/мл по оптическому стандарту мутности.

2.Внести в две пробирки с4,5 мл питательного бульона по0,5 мл стандартной бактериальной культуры Е. coli М-17, которая является гомологичной к искомому фагу.

3.Взять 2 г исследуемого материала (почвы) и суспендировать в 5 мл питательного бульона. Получить 1,0-2,0 мл фильтрата с использованием стандартных мембранных фильтров с размером пор< 1 мкм. (Использовать фильтр, изготовленный в виде шприцевой насадки).

4.Внести в одну из засеянных культурой кишечной палочки пробирок0,2 мл полученного фильтрата исследуемого материала. Вторая пробирка, содержащая питательную среду, засеянную культурой кишечной палочки, является контролем.

5.Обе пробирки помещают в термостат при37°С через 24 часа учитывают результат. При учете результатов (по Уварову) возможны следующие варианты:

А.) Содержимое опытного сосуда прозрачно, в контроле - помутнение питательной среды. Полученные данные указывает на содержание в исследуемом фильтрате бактериофага высокой активности.

128

Б.) В опытном сосуде имеется менее выраженное по сравнению с контролем помутнение среды. Это свидетельствует о содержании в исследуемом материале бактериофага средней активности.

В.) При одинаковом помутнении в обоих сосудах для окончательного заключения об отсутствии бактериофага необходимо произвести дополнительное исследование по методам Отто и Грациа.

Обнаружение бактериофага на плотных питательных средах по методу Отто

1.В эксперименте используется плотная питательная среда с содержанием не более 1,5% агара (более высокая концентрация агара угнетает развитие не-

гативных колоний бактериофага). Питательную среду засевают 0,1 мл стандартной жидкой культурой Е. coli М-17, содержащей 1·109 микробных клеток/мл по оптическому стандарту мутности. Для получения оплошного роста культуру, нанесенную в центр чашки, растирают шпателем равномерно по всей ее площади.

2.Спустя 5-10 минут после посева на подсушенную поверхность питательной среды наносят каплями по25-50 мкл исследуемый фильтрат. На одной чашке можно поставить несколько (желательно не более четырех) проб. Для этого по дну чашки намечают разделение питательной среды на секторы и в каждый сектор вносят по капле фильтрата. После с того, как жидкость впитается в среду, чашки перевертывают вверх дном и ставят в термостат при 37°С на 24 часа.

3.Учет результатов: доказательством наличия бактериофага служит полное отсутствие роста культуры в месте попадания капли фильтрата(активный бактериофаг) или появление в этом участке мелких стерильных пятенколоний бактериофага (бактериофаг слабой активности).

Обнаружение бактериофага на плотных питательных средах двухслойным методом Грациа

1.В эксперименте используется заранее подготовленная плотная питательная среда с содержанием не более 1,5% агара. В пробирку с 2,5 мл 0,7%-ного расплавленного и остуженного до температуры45°С агара вносят 0,1 мл исследуемого разведения фильтрата (учитывая высокую активность фага в пробе, использовать ее разведение в 100 раз) и 1,0 мл стандартной жидкой культуры Е. coli М-17, содержащей 1·109 микробных клеток/мл по оптическому стандарту мутности, соответствующей искомому фагу.

2.Содержимое пробирок быстро перемешивают, чтобы не произошло уплотнения агара при охлаждении, и выливают в ту же чашку вторым слоем. После застудневания агара посев ставят в термостат при 37°С.

3.Учет результатов, как правило, возможен через 24 часа после инкубации в термостате. Присутствие бактериофага определяют по наличию прозрачных пятен, хорошо видимых на матовом фоне глубинного роста бактерий.

Титрование бактериофага в жидкой среде по методу Аппельмана

Для выражения титра бактериофага можно пользоваться двумя показателями: количеством активных частиц бактериофага, содержащихся в 1 мл исследуемой жидкости, или (что проще) величиной наибольшего разведения иссле-

129

дуемой жидкости, при которой бактериофаг проявляет свое литическое действие. Полученную при этом величину выражают отрицательным логарифмом10, где степень указывает разведение фага. Средний титр бактериофага составляет 10-7.

Метод Аппельмана основан на внесении различных количеств титруемого бактериофага в бульон, засеянный одной и той же дозой культуры гомологичных микробов.

1.Десять пробирок, содержащих по 4,5 мл питательного бульона, ставят в штатив в ряд.

2.В 1-ю пробирку стерильной пипеткой вносят 0,5 мл исследуемого фага. Содержимое пробирки перемешивают и 0,5 мл жидкости из 1-ой пробирки переносят во 2-ю, из 2-ой - в 3-ю и т.д. до 8-ой включительно. Из 8-ой пробирки лишние 0,5 мл выливают. 9 и 10 пробирки - контрольные. Переносят жидкость из одной пробирки в другую каждый раз отдельной стерильной пипеткой емкостью1

мл. Таким образом, в 8 пробирках получают разведения бактериофага от1:10 до

108.

3.Во все 8 пробирок приготовленного ряда разведении вносят по0,2 мл стандартной жидкой культуры Е. coli М-17, содержащей 1·109 микробных клеток/мл по оптическому стандарту мутности, одноименных титруемому фагу.

4.Пробирка 9 - контроль культуры, содержит 5 мл бульона и 0,2 мл стандартной жидкой культуры Е. coli М-17, содержащей 1·109 микробных клеток/мл по оптическому стандарту мутности.

5.Пробирка 10 - контроль на стерильность, содержит 5 мл бульона без добавления культуры и фага. Штатив с пробирками помещают в термостат при

37°С.

6.Учет результатов производят через24 часа после инкубации. Титром считают то максимальное разведение бактериофага, при котором наблюдается полный лизис чувствительной к нему культуры. Практически это соответствует той последней пробирке в которой бульон еще остается совершенно прозрачным.

130

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ. БАКТЕРИОЦИНОГЕНИЯ. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИБИОТИКАМ

Цели занятия:

·познакомиться с лабораторными методами определения микробного антагонизма и освоить технику определения микробного антагонизма методом «агаровых блоков»;

·познакомиться с основными лабораторными методами определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и освоить технику определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом«дисков» (диффузии в агар);

Материалы и оборудование

Лабораторная посуда и вспомогательное оборудование: стерильные чашки Петри, пипетки, пробирки, флаконы, бактериальные петли, плотные питательные агаровые среды в чашках Петри, питательный бульон, физиологический раствор, стандартные диски с антибиотиками, скальпель, пинцет, образцы антибактериальных препаратов, спиртовки, термостат, штативы с пробирками для приготовления разводок, иллюстративный материал.

Бактериальные культуры: Е. coli М-17, Bacillus subtilis 5; В. licheniformis 3; В. cereus; Proteus vulgaris.

Ход работы

Выявления микробного антагонизма

1.На чашку с плотной питательной средой нанести0,1 мл стандартной жидкой культуры Е. coli М-17, содержащей 1·109 микробных клеток/мл по оптическому стандарту мутности, и равномерно распределить шпателем по всей поверхности среды.

2.Дать впитаться посевному материалу (подсохнуть засеянной поверхности среды) в течение 5-10 мин

3.Затем из другой чашки Петри с плотной питательной средой, предварительно засеянной культурой микроорганизма-антагониста(например, В. cereus), вырезать скальпелем вместе с агаром(агаровый блок в виде квадрата размерами 1х1 см) колонию (зону сплошного роста) антагониста и наложить на первую засеянную чашку (колонией кверху). На одну чашку можно положить по ее периметру, отступая 1,5 см от края чашки, три-пять агаровых блоков. Эту чашку (не переворачивая) поставить в термостат при температуре 37°С.

4.Результат учитывать через 24-48 ч: замерить диаметр стерильных зон, образуемых вокруг агарового блока с колонией микроорганизма-антагониста.

5.На занятии теоретически с преподавателем рассмотреть другие варианты выявления микробного антагонизма.