Б) Определение концентрации живых микроорганизмов путем высева на плотные питательные среды

Как известно, один из основных методов определения концентрации живых микроорганизмов в тех или иных суспензиях состоит в приготовлении высевов на плотные питательные среды, где после инкубации образуются колонии, каждая из которых, как правило, соответствует одному жизнеспособному микроорганизму. Техника статистической обработки при этом ничем не отличается от описанной выше для определений с помощью счетных камер. Следует пользоваться теми же формулами, с той лишь разницей, что под некоторыми из условных обозначений будут подразумеваться показатели, характерные для метода определения концентрации высевом на плотные питательные среды. А именно условные обозначения формул (26-33) будут иметь в этом случае следующее содержание:

- число колоний, найденных в единичном высеве на плотную питательную среду;

- среднее число колоний из найденных в серии единичных высевов одинакового разведения одной и той же культуры;

- общее число колоний, найденных во всех высевах данного разведения культуры;

- среднее взвешенное число колоний из простых средних, которые найдены при высевах разных разведений одной и той же культуры (соответствует максимальному из разведений);

- кратность разведения высеваемой микробной суспензии;

- объем единичной посевной дозы в миллилитрах;

- число живых микроорганизмов в 1 мл исходной культуры.

Прежде чем обратиться к примерам, напомним, что применение излагаемых в этом подразделе статистических приемов оправдано лишь при условии строгого соблюдения к методам определения, которые перечислены ранее (на стр. 70 в оригинале). Если в высеваемой культуре много конгломератов бактерий, которые при высеве дают единичные колонии, или условия опыта и свойства микроорганизмов таковы, что существенная доля высеянных единичных особей не образует колоний, то следует использовать вместо описанных здесь приемов общие методы статистической обработки, изложенные в гл. 1.

Приведем теперь примеры соответствующих расчетов. Допустим, сравниваются две серии живой вакцины СТИ. После высева I вакцины в разведении 1:10³ на поверхность агара в трех чашках Петри найдены следующие количества колоний: 116, 114 и 121. После высева II вакцины в разведении 1:10⁴ на 5 чашках найдено 22, 31, 26, 29 и 34 колонии. Посевная доза (на каждую чашку) – 0,5 мл. Вычисляем общее число колоний, найденных во всех трех чашках с посевом I вакцины - . Соответствующая величина для II вакцины составляет . Среднее число колоний на чашках с I вакциной составит: , а со II вакциной - . По формуле (27^б) доверительные интервалы средних для вероятности 99 % составят соответственно:

и ,

а в относительном выражении доверительные интервалы как для средних и , так и концентраций исходных культур и составляет с вероятностью 99 % (по формуле 28^б):

%

и %.

Сами по себе концентрации в исходных культурах могут быть вычислены по формуле (29^а) и составят:

клеток/мл;

клеток/мл.

Посмотрим теперь, достоверно ли обнаруженное различие концентраций I и II вакцин, не может ли оно быть отнесено за счет ошибки разведения. Воспользуемся формулой (32^б). Левая часть неравенства составит , а правая - .

Поскольку , то различие между концентрациями можно признать достоверным с вероятностью заведомо большей 99 %. Наконец, вычислим отношение концентраций: . Доверительный интервал отношения с вероятностью 99 % составит по формуле (33^б):

.

Таким образом, истинная величина отношения концентраций с вероятностью 99 % заключена в интервале .

В заключение рассмотрим случай определения концентраций живых микроорганизмов по результатам высева на плотную среду двух различных разведений одной и той же культуры. При посеве на три чашки с агаром суспензии клеток Cl. sporogenes в разведении 1:10000 получено 101, 86 и 94 колонии. Посевная доза – 1 мл. Аналогичный высев из разведения 1:30000 привел к образованию 43, 36 и 29 колоний. Соответствующие средние количества колоний на чашку для каждого из разведений составят и . Среднюю взвешенную , соответствующую максимальному из разведений, вычисляем по формуле (30):

.

Тогда по формуле (29^б) исходная концентрация составит клеток/мл. Доверительный интервал найденного значения концентрации вычислим с вероятностью 95 % по формуле (31^б):

%.

Таким образом, в абсолютном выражении истинная концентрация Cl. sporogenes с вероятностью 95 % заключена в интервале от 875000 до 1075000 клеток/мл.