Вопросы для самоконтроля

1. Какие электроды используют в качестве электродов сравнения?

2. Каково устройство хлорсеребряного электрода?

3. Каково устройство стеклянного электрода?

4. Каковы особенности потенциометрического определения нитратов в сельскохозяйственной продукции?

5. Как определить содержание нитрат-ионов в растительной продукции?

Лабораторная работа № 20 Фотоколометрическое определение содержания лактозы в молоке и растворимых белков в мясе

Цель работы - определить фотоколориметрически концентрацию лактозы в молоке и растворимого белка в мясе.

Для успешного выполнения данной работы необходимо ознакомиться с теоретическим материалом, изложенным в лабораторной работе №10. Метод фотоколориметрического определения содержания лактозы в молоке основан на способности моно-, ди- и полисахаридов со свободными и потенциально свободными редуцирующими группами окрашиваться от светло-жёлтого до жёлто-коричневого цвета при действии фенола и концентрированной серной кислоты.

Практическая часть

1. Приготовление стандартных растворов лактозы

Для построения калибровочного графика 0,0125 г чистой лактозы (моногидрат) растворите в мерной колбе на 250 мл. Микропипеткой внесите в сухие и чистые пробирки от 0 до 2 мл (с интервалами в 0,2 мл) раствора лактозы и долейте воды до 2 мл, внесите в первую пробирку только 2 мл воды (смотри таблицу 20.1).

Таблица 20.1  Приготовление стандартных растворов лактозы

№ раствора	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
Vр-ра лактозы, мл	0	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0	1,2	1,4	1,6	1,8	2,0
V воды, мл	2	1,8	1,6	1,4	1,2	1,0	0,8	0,6	0,4	0,2	0,0
Слактозы, мкг/ 2 мл	0	10	20	30	40	50	60	70	80	90	100

В каждую колбу прибавьте 6 капель раствора фенола (80 г кристаллического фенола +20 мл воды нагревают при до полного растворения и хранят в тёмной бутылке). После этого в каждую пробирку прилейте по 5 мл концентрированной серной кислоты.

1. Измерение оптической плотности стандартных растворов. Построение калибровочного графика

Измерьте оптические плотности всех стандартных растворов на выбранном светофильтре, и постройте калибровочную прямую (см. работу 10).

Измерения оптической плотности необходимо начать с раствора наименьшей концентрации. Результаты измерений занесите в таблицу 20.2.

По полученным данным (таблица 20.2) на миллиметровой бумаге постройте калибровочную прямую D = f (C) .

Таблица 20.2  Оптические плотности стандартных растворов

№ раствора	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
Концентрация, C
Оптическая плотность, D

0. 3. Определение содержания лактозы в молоке

1 г молока перенесите количественно в мерную колбу на 1 литр, доведите водой до метки и перемешайте. 2 мл этого раствора налейте в чистую и сухую пробирку, прибавьте 6 капель раствора фенола, добавьте 5 мл концентрированной серной кислоты и перемешайте. Сразу же появляется жёлто – коричневая окраска, быстро доходящая до максимума. Спустя 15 минут, не охлаждая, определите оптическую плотность раствора при . Содержание лактозы в молоке рассчитайте по формуле:

, (1)

где g – содержание лактозы в 2 мл разведённого молока, найденное по калибровочному графику (мкг).

4.Определение содержания водорастворимых белков мяса с биуретовым реактивом

Результаты многочисленных исследований свидетельствуют о незначительной изменчивости и относительном постоянстве химического состава мышечной ткани животных. Количество белка при этом колеблется в пределах 18,51,85 %, на долю воды приходится 75,3%, прочие вещества составляют 0,1–0,3 %, зола 1,10,1%.

Все белки можно подразделить на:

1. сакроплазматические: миоген, глобулин Х, миоглобулин, миоглобин –это водорастворимые белки, находящиеся в сакроплазме;

2. миофибриллярные: миозин, актин, тропомиозин – водорастворимые белки, находящиеся в миофибриллах и участвующие в сокращениях,

3. белки стромы: коллаген и эластин – нерастворимые в воде и солевых растворах.

Доля водорастворимых белков в общей сумме белков составляет 90%.

Метод определения содержания водорастворимых белков с биуретовым реактивом основан на образовании окрашенного комплекса пептидных связей белков с ионами Cu⁺² в щелочной среде. Белок извлекается из мяса солевым раствором, затем к этому раствору добавляется биурет и по интенсивности окраски фотоколориметрически, используя калибровочный график, определяется содержание белка.

4.1.Извлечение белковой фракции из образца

Полнота извлечения белка зависит от измельчения мяса, природы экстрагирующего раствора и времени экстракции. Взвесьте 3 г мяса, измельчите и добавьте 20 мл 0,6 М раствора KCl. Суспензию интенсивно перемешивайте на магнитной мешалке 20 минут.

2. Приготовление биуретового реактива

Возьмите 0,15 г CuSO₄, 0,6 г сегнетовой соли и всё это растворите в 50 мл дистиллированной воды. Далее при перемешивании прилейте 30 мл 10 % -го раствора NaOH и 0,1 г KI. Объём раствора доведите до 100 мл. Всё это лучше делать в мерной колбе на 100 мл.

2. Получение окрашенных комплексов белка мяса

Суспензию мяса в растворе KCl отфильтруйте. Возьмите 2 мл фильтрата, добавьте 5 мл раствора биурета и перемешивайте 20 минут. Полученный раствор отфотоколориметрировать.

4.4. Построение калибровочного графика

Для получения калибровочной зависимости оптической плотности от содержания белка в растворе используйте серию стандартных растворов альбумина. Для этого приготовьте по 10 мл следующих растворов: С₁ = 2 мг/мл; С₂ = 6 мг/мл; С₃ = 10 мг/мл; С₄ = 14 мг/мл; С₅ = 18 мг/мл. Возьмите пять чистых пробирок, добавьте в каждую по 2 мл стандартного раствора альбумина и по 5 мл раствора биурета. Выдержите 20 минут и фотоколориметрируйте на КФК–2. Данные занесите в табл. 20.3.

Таблица 20.3  Данные фотоколориметрирования стандартных растворов альбумина

Концентрация альбумина,	2	6	10	14	18
Оптическая плотность, D

Рисунок 20.2  Зависимость

По данным таблицы 20.3 постройте графическую зависимость (рисунок 20.2) оптической плотности от концентрации белка (альбумина) в растворе. Далее эта зависимость и будет тем калибровочным графиком, по которому будем находить содержание белка в экстракте мяса.

4.5.Определение содержания белка в мясе

Окрашенный раствор, полученный на основе экстракции мяса отфотоколориметрируйте. Используя найденную для этого раствора оптическую плотность (D) по калибровочному графику (рисунок 20.2) найдите концентрацию белка в растворе в мг/мл (C). Для расчёта содержания белка в мясе в мг/г мяса () необходим перерасчёт:

Или в процентах по массе():