1.5. Кріоконсервація як невід’ємна складова сучасної ембріотрансплантації

Прогрес у вивченні репродуктивної функції самок, фізіології оогенезу і раннього ембріогенезу ссавців, розробці і виробництві високоефективних препаратів і середовищ дозволив створити ряд сучасних біотехнологій по використанню жіночих статевих клітин і ембріонів для прискореного розмноження видатних тварин. Це – трансплантація ембріонів, дозрівання і запліднення ооцитів поза організмом, мікро хірургічний поділ зародків і ін. Проте, усі відомі засоби використання яйцеклітин і ембріонів для біотехнологічних цілей стикаються з однією і тією ж проблемою: ефективністю їх використання для одержання живого нащадка, що потребує запасу пластичного матеріалу на кожному з технологічних етапів. Єдиним надійним засобом створення таких запасів шляхом зворотнього введення біооб’єктів в анабіоз є заморожування і збереження їх при низьких температурах.

У теперішній час для заморожування зародків сільськогосподарських тварин використовуються різноманітні технологічні засоби, однак цілком процес заморожування та використання зародків залишається досить складним. Це обумовлено складністю будови яйцеклітин і ембріонів ссавців і їхньою унікальністю як біологічного об’єкта. Пошук оптимальних режимів проводився, як правило, емпірично, що потребує тривалих і дорогих експериментів у випадку з ембріонами сільськогосподарських тварин [ 1 ].

Як відзначав ще в 1973 році основоположник методу кріоконсервації ембріонів великої рогатої худоби І. Вільмут, основними завданнями дослідників будуть одержання середовища для заморожування і визначення оптимального режиму зниження температури [ 2 ]. Подальший розвиток кріобіологічної науки підтвердив правильність цього пророкування: більшість досліджень було спрямовано на рішення саме цих двох питань. Спрощення режиму заморожування багатьма дослідниками велося за рахунок збільшення швидкості зниження температури в окремих температурних діапазонах і скорочення процесу заморожування, тобто переносу ембріонів у рідкий азот при більш високих температурах.

Основні особливості і закономірності заморожування ембріонів. Режим заморожування в першу чергу визначається двома властивостями: стійкістю клітин до температурного шоку і процесом дегідратації і внутрішньоклітинної кристалізації. Усі режими заморожування, що існували, передбачували повільне (близько 1⁰С у хвилину) охолодження в діапазоні позитивних температур. Оптимальні результати дозволили запропонувати простий метод короткострокового збереження ембріонів великої рогатої худоби. Ембріони, заряджені в паєти для пересадки, занурюють в льодяну баню і зберігають там до 36 годин. Приживленість таких ембріонів склала 56% і вірогідно не відрізнялася від приживленості свіжоотриманих ембріонів.

Другим фактором, що визначає швидкість зниження температури, є одержання необхідного ступеня зневоднювання клітин.

Чим менше швидкість охолодження клітин, тим менше вільної води залишається в клітині. При даній температурі витримувати замороження будуть лише ті ембріони, що до моменту внутрішньоклітинної кристалізації не містять вільної води. Графіки зневоднювання показують, що це можливо при швидкостях охолодження 0,3-0,5 ⁰С у хвилину.

Зневоднювання клітин відбувається в температурному інтервалі, коли утворюються перші кристали льоду при ініціації кристалізації до моменту внутрішньоклітинного замерзання. Значення цих температур є базовими у розробці режиму охолодження. Виділення прихованої теплоти кристалізації, початкове переохолодження є зміна режиму заморожування після кристалізації середовища не впливають на збереженість деконсервованих ембріонів [ 5, 19 ].

Заморожування ооцитів і ембріонів ссавців з використанням високих швидкостей заморожування-відтавання. Існує спосіб заморожування біологічних об’єктів, коли цитоплазма не зневоднюється протягом поступового зниження температури, а переводиться в склоподібний стан при над швидкому охолодженні. Заморожування ооцитів, яйцеклітин і ембріонів методом вітрифікації знайшло вже досить широке застосування в біотехнологічних лабораторіях.

Сутність методів, які засновані на використанні над швидкого заморожування полягає в тому, що після відповідної обробки в розчині кріопротектора біооб’єкт безпосередньо занурюється в рідкий азот.

За класичним поняттям вітрифікація – це такий спосіб кріоконсервування суспензій, коли рідкий стан такої суспензії переходить в твердий без утворення кристалів.

При заморожуванні за допомогою прямого занурення у рідкий азот умови для виключення внутрішньоклітинного кристалоутворення забезпечується обробкою ембріонів до заморожування. Для цього необхідно наситити ембріони проникаючим кріопротектором у високій концентрації і потім збезводнити їх у гіпертонічному розчині непроникаючого кріопротектора. Крім того, додається сахароза в концентраціях 0,25-0,5 М. в результаті чого, після прямого занурення у рідкий азот вода не кристалізується, а переходить у склоподібний стан [ 2 ].

Кріоконсервація шляхом вітрифікації значно спрощує безпосередньо режим заморожування і це головна перевага даного методу. Однак вітрифікація біооб’єктів може бути успішною тільки у висококонцентрованих розчинах захисних речовин (50% і більше). Це значно ускладнює етапи підготовки ембріонів до заморожування і особливо, повернення їх у фізіологічні умови. Складності методу вітрифікації нівелюють його переваги та обмежують практичне застосування. Рішення основних задач кріоконсервації методом вітрифікації таке: 1) одержання висококонцентрованих нетоксичних розчинів; 2) запобігання осмотичного шоку при еквілвбрації ембріонів у розчинах кріопротекторів і повернення їх у фізіологічні умови; 3) досягнення високих швидкостей заморожування для вітрифікації; 4) одержання високих швидкостей відтавання для запобігання рекристалізації [ 6 ].

Методи заморожування при надвисоких швидкостях. Новим підходом у кріоконсервації ооцитів і ембріонів ссавців є метод відкритих витягнутих соломин діаметром 0,8 мм, що дозволяє реалізувати дуже високі швидкості заморожування-відтавання (близько 6*10³/9*10³ С⁰/хв) і забезпечує короткий контакт між біооб’єктом і висококонцентрованим кріозахисним середовищем (приблизно 30 секунд). Даний метод дає можливість уникнути холодового ушкодження і зменшити вплив токсичних і осмотичних ефектів. Для зниження можливості забруднення біооб’єктів вірусами заморожування проводять у рідкому азоті, відфільтрованому від бактерій і грибів [ 5 ].

Отримані за допомогою методу відкритих витягнутих соломин результати можуть бути охарактеризовані мінімальним холодовим ушкодженням, коротким часом експозиції в токсичних розчинах кріопротектора і виключенням структурного ушкодження. Метод є ефективним для кріоконсервації in vitro отриманих ембріонів на стадії предкомпактизації, які надзвичайно чуттєві до кріоушкоджень [ 14 ].

Характерною рисою даного способу є використання оптимального співвідношення величини швидкості відтавання до заморожування.

Вітрифікація є перспективним методом кріоконсервації ембріонів і ооцитів ссавців. Однак на сьогоднішній день ефективність методів, заснованих на використанні високих і надвисоких швидкостей заморожування-відтавання, і на застосуванні повільних режимів заморожування, приблизно однакова, що не дає можливості однозначно віддати перевагу одному з цих напрямків [ 1 ].