01005056085
.pdf
Эти данные позволили использовать NLS-TSF7 в системе регенерационной терапии поверхностных повреждений млекопитающих. Перенос вектора экспрессии гена инсулиноподобного фактор роста I типа человека pCMVIGF-ls (Иванов И.А. и др., 2007) в поверхностные раны мышей (DBA, самцы, 6 недель) осуществляли с помощью молекулярного конъюгата NLS-TSF7. В эксперименте было сформировано 4 фунпы животных, по 10 мышей в каждой. Мышей из опытной группы инъецировали 50 мкг либо свободной pCMVIGF-ls, либо комплексами pCMVIGF-ls/NLS-TSF7. Контрольных мышей инъецировали плазмидной ДНК с делегированным промотором (pdellGF-ls) или свободным NLS-TSF7. На 3, 5 и 7 сутки по две мыши из каждой группы умерщвляли и из областей, прилегающих к ране, выделяли РНК, которую использовали для количественной оценки экспрессии IGF-1 методом RealTime ОТ-ПЦР. Уровень экспрессии гена IGF-1 на 3 и 5 сутки после начала эксперимента был выше от 64 до 128 раз при инъекциях комплексов pCMVIGF-ls/NLS-TSF7 по сравнению с инъекциями свободной pCMVIGF-ls (рис. 6). У мышей контрольной фуппы, инъецированных плазмидой с делегированным промотором, или свободным молекулярным конъюгатом NLS-TSF7, экспрессии IGF-I человека зарегистрировано не было. Эти данные подтверждают ранее полученные результаты о высокой эффективности молекулярного конъюгата NLS-TSF7 при доставке генов в поверхностные ткани млекопитающих.
Врем.4 |
1 день |
7 день |
10 день |
14 день |
21 день |
Я 3 1 В 0 Т Н ЫХ |
|
|
|
|
|
pCMVIGF-ls |
60±13.5 |
28.5±6 |
12±3 |
0 |
0 |
pCMVIGF-ls |
57±11.2 |
24 ±7.5 |
б±2 |
0 |
0 |
/NLS-TSF7 |
|
|
|
|
|
pdellGF-ls |
бб±20 |
42±9 |
24±5.5 |
10.5±б |
0 |
NLS-TSF7 |
62±13.5 |
4б.5±8 |
28.5±б |
10.5±4.5 |
0 |
Таблица |
1. В таблице приведены средние значения площади раны (в мм') |
||||
в экспериментальных |
н контрольных |
группах |
мышей: |
рСМ\'ЮР-18 - |
|
мыши, инъецированные свободным вектором экснрессии инсулин-подобного фактора роста I типа человека; рСМ\'ЮР-15/МЬ5-Т8Р7 - мыши, инъецированные комплексами рСМ\'10Г-15/ЫЬ8-Т8Р7; рс1е110Г-18 - мыши, инъецированные свободным вектором экснрессии инсулин-подобного фактора роста I типа человека с делетированным промотором; ЫЬ8-Т5Р7 - мыши, инъецированные свободным молекулярным конъюгатом ЫЬ8-Т8Р7.
13
Оценку скорости регенерации проводили, измеряя площадь ран на 7, 10, 14 и 21 сутки после начала эксперимента. Результаты суммированы в таблице 1. Инъекции как свободной pCMVIGF-ls, так и комплексов pCMVIGF-ls/NLS-TSF7 приводили к существенному ускорению процесса заживления раны по сравнению с контрольными животными. Через 14 суток после начала эксперимента у мышей, инъецированных комплексами pCMVIGF-ls/NLS-TSF7, происходило полное заживление раны, тогда как в контроле площадь раны составляла около 10 мм^ (-17% от исходного размера, таблица 1). Более того, у мышей, инъецированных комплексами pCMVIGF-ls/NLS-TSF7, на 10 сутки после начала эксперимента, размер раны был в два раза ниже, чем у мышей, инъецированных свободной плазмидой, и в 4 раза ниже, чем у контрольных групп. Полученные результаты свидетельствуют об эффективности разработанной системы невирусной регенерационной генотерапии поверхностных повреждений млекопитающих.
Влияние структуры гена anoAl человека на продолжительность его экспрессии
после переноса в печень мышей
В предыдущих работах (De Geest В. et al., 2000; Акифьев Б.Н. и др., 2004) было показано, что в отличие от конструкции pCMVapo (кДНК копия гена апо AI под контролем промотора CMV), геномный вариант гена апо AI человека с полноразмер-
ной (-6194...+ 1 н.п. ) 5'- и 3'- регуляторной областью (плазмида pAlg) способен поддерживать долговременную экспрессию более двух недель) после переноса в печень мышей методом гидродинамических инъекций. На продолжительность экспрессии перене-
сенного гена могут влиять 5'- и 3'- регуляторные области, регуляторные элементы, |
ко- |
||||
торые могут находиться |
в кодирующей части и сама экзон-интронная структура |
гена |
|||
(De Geest В. et al., 2000). Для установления роли собственно экзон-интронной |
структу- |
||||
ры геномного гена был |
получен делеционный |
вариант плазмиды |
pAlg - |
плазмида |
|
pSApo, представляющая |
собой ген апо AI человека с сохранённой |
экзон-интронной |
|||
структурой и усеченной 5'-регуляторной областью |
(-256...+1 н.п. относительно точки |
||||
инициации транскрипции), содержащей собственно промотор гена и гепатоцитарный энхансер. Данный район 5'-регуляторной области гена апо AI необходим и достаточен для его тканеспецифической экснрессии в гепатоцитах (Widom R.L. et al., 1991). Перенос генетических конструкций с геном апо AI человека в печень мышей проводили методом гидродинамических инъекций (Акифьев Б.Н. и др., 2004). Установлено, что уда-
14
Таким образом, в результате данной работы созданы молекулярные конъюгаты, способные эффективно доставлять ДНК в клетки млекопитающих рецептор-опосредо- ванным эндоцитозом через рецепторы люлиберинов (конъюгат NLS-LHRH), или трансферриновый рецептор (конъюгаты NLS-TSF7 HNLS-TSF12). Созданные молекулярные конъюгаты успещно апробированы на модели суицидальной генотерапии опухолей in vitro и модели регенеративной генотерапии поверхностных повреждений мыщей in vivo. Изучены генетические факторы, влияющие на работу перенесенного гидродинамическими инъекциями гена ano А! человека в организме мышей. В частности, установлена принципиальная важность второго интрона гена ano А1 человека в поддержании продолжительной (более недели) его экспрессии в печени мышей после гидродинамического переноса.
16
|
выводы |
1.KaTiioiiiibiií псптнл |
NLS, несмотря na формирование комплексов |
с ДНК, НС способен |
доставлять ДНК в клетки человека in vitro |
но является перспективным носителем ДНК при разработке на его основе активных молекулярных конъюгатов.
2.Молекулярные конъюгаты на основе аналогов люлиберина (NLSLHRH и Nukl) и трансферрппа (NLS-TSF7) способны к переносу плазмидной ДНК в культивируемые клетки человека рецеитороносредованным эндоцитозом.
3.В модели «суицидной» геиотерании опухолей in vitro конъюгаты
NLS-LHRH |
n Nukl |
оказались |
эффективным |
средством |
|
иаиравлениого переноса гена тимидицкнназы |
герпесвируса. |
||||
4. Локальный перепое комплексов пептида NLS-TSF7 с плазмидиым |
|||||
вектором |
экспрессии |
писулипоподобпого |
фактора |
роста I |
|
в повреждённые поверхностные тканн мышей ускоряет заживление
ран.
5. Продолжительная, не меиее двух педель, экспрессия гена аполипопротеииа Al человека после гидродипамического переноса
в печень мьнией обеспечивается вторым интропом гена.
17
список РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
|
|
|
публикации в изданиях, рекомендованных ВАК России |
|
|
|
|
||||||||||
1) |
Акифьев Б.Н., Днже |
Э.Б., Ефремов A.M., Могиленко |
|
Д.А., Олейникова |
Г.Н., |
||||||||||||
|
Лапиков И.А., |
Жданова |
O.A., |
Кидготко |
О.В., Орлов |
C.B., |
Перевозчиков А.П. |
||||||||||
|
Перенос |
гена |
человеческого |
аполипопротеина |
A-I |
|
мышам |
методом |
|||||||||
|
гидродинамических |
инъекций: |
факторы, |
влияющие |
на |
эффективность |
|||||||||||
|
и продолжительность |
экспрессии |
гена |
в печени |
животного. |
|
Молекулярная |
||||||||||
|
биология, Т. 38, С. 1076-1084, 2004. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
2) |
Диже Э.Б., |
Игнатович |
И.Л., |
Буров C.B., |
Похвощева |
A.B., |
|
Акифьев Б.Н., |
|||||||||
|
Ефремов A.M., |
Перевозчиков А.П., |
Орлов |
C.B. Комплексы |
ДИК |
с катионными |
|||||||||||
|
пептидами: условия |
формирования |
и факторы, |
влияющие |
на |
их |
проникновение |
||||||||||
|
в клетки млекопитающих. Биохимия, Т. 71, №. 12, С. 1659-1667, 2006. |
|
|
|
|||||||||||||
3) |
Ефремов |
A.M., Буглаева |
А.О., Орлов C.B., Буров C.B., |
Игнатович |
И.А., |
Диже |
|||||||||||
|
Э.Б., Шавва B.C., Перевозчиков А.П. Перенос генетических конструкций |
через |
|||||||||||||||
|
трансплацентарный барьер в зародыши мыши. Онтогенез, Т. 41, |
№ |
2, |
С. |
94-100, |
||||||||||||
|
2010. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
4)Ефремов A.M., Духовлинов И.В., Диже Э.Б., Буров C.B., Леко М.В., Акифьев Б.Н., Могиленко Д.А., Иванов И.А., Перевозчиков А.П., Орлов C.B. Невирусная регенеративная генотерапия повреждений кожных покровов млекопитающих. Цитология, Т. 52, № 5, С. 371-379, 2010.
5) |
Буров C.B., Яблокова Т.В., Дорош |
М.Ю., Кривизюк Е.В., Ефремов A.M., |
Орлов |
||||||||
|
C.B. Аналоги люлиберина, содержащие последовательность ядерной локализации |
||||||||||
|
Т-антигена вируса SV-40. Биоорганическая химия, Т. 36, № 5, С. 630-637, 2010. |
||||||||||
6) |
Яблокова Т.В., |
Челушкнн П.С., |
Дорош |
М.Ю., Ефремов A.M., Орлов |
C.B., |
||||||
|
Буров C.B. Синтез |
аналогов люлиберина и их использование в системах |
адресной |
||||||||
|
доставки генов. Биоорганическая химия, 38(1), 31-39, 2012. |
|
|
|
|
||||||
7) |
Ефремов A.M., |
|
|
другие публикации |
|
|
|
|
|||
Акифьев Б.Н., |
Диже |
Э.Б., |
Могиленко |
Д.А., |
Олейникова |
Г.Н., |
|||||
|
Лапиков И.А., Жданова О.Ю., Орлов C.B., Перевозчиков А.П. Влияние структуры гена |
||||||||||
|
Аполипопротеина A-I человека на его экспрессию после переноса мышам методом |
||||||||||
|
гидродинамических инъекций. Медицинская Иммунология, тезисы IX Конференции |
||||||||||
|
«Дни Иммунологии в Санкт-Петербурге», Т. 7, №2-3, 2005 |
|
|
|
|
||||||
8) |
Ефремов A.M., |
Акифьев Б.Н., |
Диже |
Э.Б., |
Могиленко |
Д.А., |
Олейникова |
Г.Н., |
|||
|
Лапиков И.А., |
Жданова О.Ю., |
Орлов |
C.B., Перевозчиков А.П. |
Экспрессия |
геиа |
|||||
|
Аполипопротеина |
A-I человека после его переноса |
мышам |
методом |
|||||||
|
гидродинамических инъекций. Онтогенез, тезисы докладов XIV школы «Биология |
||||||||||
|
развития», Т. 36 №5, 2005. |
|
|
|
|
|
|
|
|
||
9)Орлов C.B., Диже Э.Б., Игнатович H.A., Буров C.B., Яблоква Т.В., Ефремов A.M., Акифьев Б.Н., Перевозчиков А.П. Суицидная генотерапия гормончувствительных опухолей человека: разработка невирусиой системы направленного переноса гена тимидинкиназы вируса простого герпеса первого типа на ос1Юве аналогов люлиберинов. Сборник трудов конференции ««Живые системы» в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2007-2012 годы», 2008
10)Иванов И.А., Духовлинов И.В., Буров C.B., Ефремов A.M., Акифьев Б.Н., Диже Э.Б., Могиленко Д.А., Перевозчиков А.П.,Орлов C.B. Система невирус1ЮЙ регенеративной генотерапии поверхностных повреждений тканей человека. Сборник трудов конференции ««Живые системы» в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», 2009
18