4.7 Изготовление срезов растений и подготовка предметных и покровных стёкол

Анатомические исследования подразумевают, прежде всего, подготовку объектов изучения таким образом, чтобы его можно рассматривать в микроскоп. Наиболее широко распространенным типом микроскопа, особенно на уровне студенческих исследований, является световой, а значит, объект должен пропустить через себя пучок света.

Из растительных объектов готовят тонкие срезы, толщиной 8 - 25 мкм. Изначально готовили срезы опасной бритвой от руки. Объект зажимают между кусочками сердцевины бузины (сейчас используют пенопласт, сердцевину топинамбура). Это очень трудоемкий способ, требующий отработанных навыков. Безусловно, таким способом, работая безопасной бритвой, нельзя подготовить массовый материал, серийные срезы, срезы значительной площади.

Совершенно изменилась технология работы с изобретением микротома. Эволюция этого аппарата прошла очень быстро по пути совершенствования. Наиболее трудной задачей является механизм закрепления объекта, из которого необходимо изготовить срезы. Если древесина как твердый материал может быть укреплена зажимами, то мелкие объекты (семена), мягкие (лист, кора) не могут быть закреплены таким образом. Есть методы специальной обработки материала (заливка в целлоидин, парафин), но они трудоемки и требуют значительного времени. Чтобы выполнить ВКР с использованием этих методов, надо работать с материалом не менее 3-х лет. Огромным прогрессом стало изобретение замораживающих столиков. Объект к ним прикрепляется с использованием низких температур.

Эти столики могут работать с использованием углекислоты, что более приемлемо для мягких животных тканей, особенно в медицине. В ботанике наиболее удобным являются столики, работающие по типу «холодильника». Постоянный ток проходит через термопару, тепло удаляется проточной водой.

Из зафиксированного материала готовят микрообъекты в виде кубиков или призм. Площадь поперечного среза зависит от характера материала. Если он однородный, то может быть больше, а если его структура гетерогенна (на границе коры и древесины), то не более 0,5 × 0,5 см; для продольных срезов (радиальный, тангентальный) один из размеров (по направлению оси органа) желательно делать длиннее (до 0,7 - 0,8 см). Приготовленный таким образом материал выдерживают в воде не менее 0,5 часа (лучше дольше), меняя через 10 - 15 минут воду. Таким образом, спирт удаляют из объекта и он хорошо примораживается. Древесину перед изготовлением микрообразцов следует варить в смеси воды и глицерина (1:1) в огнеупорной колбе на электрической плитке в течение 5 - 6 часов. Вода испаряется и ее следует периодически доливать, но ни в коем случае не в кипящую массу, а только после некоторого охлаждения с соблюдением осторожности. В противном случае происходит выброс горячей массы, который может привести к повреждению лица и рук. После такой подготовки древесина становится очень эластичной, и длина поперечного среза может достигать 2 см.

Подготовленные микрообъекты ориентируют на замораживающем столике соответствующим образом, включают вначале воду и спустя 3 - 4 минуты выпрямитель переменного тока в постоянный и наносят на объект по каплям пипеткой воду до тех пор, пока весь объект не будет покрыт небольшим куполом льда. Со стороны, противоположной движению ножа, намораживается большая площадь льда, т.к. надо обеспечить упор давлению ножа.

При резке растительных объектов необходимо помнить, что в любом органе присутствуют как мягкие не одревесневшие ткани, так и механические, сильно лигнифицированные. Поэтому очень важно «найти» правильный угол наклона ножа, угол между лезвием ножа и направле­нием его движения.

Толщину среза или устанавливают фиксированную, в этом случае доведение ножа назад до упора обеспечивает поднятие столика на толщину среза, или устанавливают вручную, поднимая после каждого среза замораживающий столик.

Разнообразие растений обуславливает и разнообразие подходов в процессе резки. Очень хорошо режутся лимонник, липа, бузина, очень трудно объекты с твердой древесиной, поэтому каждый новый объект требует некоторого испытания разных приёмов.

Одним плавным, без рывков, движением ножа на себя производят срез, кисточку (желательно беличью) каждый раз смачивают в воде, движением по ножу на себя снимают срез и помещают его в бюксу с водой (ни в коем случае не спиртом, т.к. кисточка, смоченная спиртом, будет переносить его на объект, и приведет к разрушению блока).

Изготовление срезов на микротоме позволяет получить их значительное количество, а значит, позволяет вести отбор для изготовления препаратов. Необходимо готовить срезы разной толщины. Сделать очень тонкий срез, пригодный для фотографирования, но большой площади, невозможно. Срезы большой площади дают возможность судить о соотношении тканей, их топографии.

Если полученные срезы сразу не будут использованы для изготовления препаратов, то в воду следует добавить спирт, и препараты можно сделать на второй день.

Из полученных срезов готовят временные и постоянные препараты, но этому предшествует подготовка предметных и покровных стекол. Основные требования к ним: стекла должны быть обезжирены, что достигается тщательной промывкой. Стекла моют в горячей воде с мылом, протирая с обеих сторон щеточкой. Затем помещают в емкости с наструганным мылом и кипятят в течение часа, осторожно переворачивая их. Не рекомендуется использование специальных порошков, т.к. они оставляют на поверхности налет.

После кипячения стекла тщательно промывают в холодной воде под краном и погружают в насыщенный водный раствор двухромовокислого калия с крепкой серной кислотой в пропорции 3:1 или 4:1 (хромпик). В этой смеси стекла хранят не менее суток, используя по мере необходимости. Перед изготовлением препаратов стекла хорошо промывают от хромпика.

Можно промытые в мыльной воде стекла поместить на несколько часов в 10-15% раствор калийной щелочи, затем промыть водой и перенести в слабый 1-5% раствор соляной кислоты и через 1-2 минуты снова промыть водой.

Предметные стекла, на которые помещают препараты, должны быть хорошо обезжирены и промыты. На правильно подготовленных стёклах нанесенные капли воды хорошо растекаются. Если же на стекле остались следы жира, то вода собирается каплями, не растекаясь. На такие стекла срезы накладывать не следует, так как они не закрепляются на нем.

4.7.1 Изготовление временных препаратов

Для первоначального знакомства с полученными срезами, а иногда и для наблюдения, готовить постоянные препараты нецелесообразно. В этом случае ограничиваются временными препаратами, которые хранят непродолжительное время. Средой, в которую помещают срез, является вода, если материал свежий, т.е. живой. Если материал зафиксирован, то для этой цели используют глицерин (чистый или разбавленный водой) или другие просветляющие жидкости.

Срезы помещают в чистый или слегка разбавленный глицерин, в котором они могут находиться до нескольких месяцев. Для более длительного хранения покровное стекло обводят жидким парафином или канадским бальзамом, чем достигается прикрепление покровного стекла к предметному.

4.7.2 Окраска срезов и приготовление постоянных препаратов

Если срезов несколько, то их окрашивают на предметом стекле. Но при изготовлении срезов на микротоме их готовят несколько десятков, что делает возможным выбор, тогда срезы окрашивают в небольших бюксах. В этом случае срезы помешивают очень осторожно кисточкой, чтобы предотвратить слипание и обеспечить равномерное окрашивание.

Для окрашивания срезов из вегетативных органов растений используют чаще всего сафранин и водный или нильский синий. Вообще, красителей много, их применение обусловлено характером и природой объекта.

Итак, в бюксы, где в воде находятся срезы, добавляют сафранин. В сафранине срезы следует выдерживать не менее 30 минут. Затем, осторожно сливая и добавляя воду, промывают срезы для удаления сафранина. На приготовленное предметное стекло наносят пипеткой несколько капель воды и препаровальными иглами или кисточкой извлекают из стаканчиков (лучше их перелить в чашку Петри) окрашенные сафранином срезы и кладут на предметное стекло. Срезы подбирают по величи­не, как по всей площади объекта, так и более мелкие кусочки, которые, как правило, тоньше. На срезах большей площади устанавливают расположение и соотношение тканей, а тонкие срезы более пригодны для микрофотографирования.

Заранее готовят полоски фильтровальной бумаги по площади в 2 раза превышающие ширину предметного стекла и чуть больше по длине. Берут несколько полосок и, постепенно прижимая их к стеклу по направлению к себе, убирают воду, при этом после полного контакта со стеклом пальцами с нажимом разглаживают бумагу, это обеспечивает хорошее отхождение срезов от фильтровальной бумаги. Подняв бумагу, отбрасывают 2-3 слоя, впитавшие воду, и сразу на срезы пипеткой наносят водный или нильский синий, выдерживают в нем 1-2 минуты (поперечные срезы выдерживают дольше, чем продольные) и таким же приемом фильтровальной бумагой удаляют синюю краску. Далее на срезы поочередно наносят 50%, 75% и 96% спирт, выдерживая в каждом, несколько минут и убирая фильтровальной бумагой. Такое же обезвоживание производят несколько раз, пока не будет заметна резкая разница в окраске разных тканей. Этот прием называют дифференцировкой окраски.

Сафранин окрашивает одревесневшие элементы, а нильский синий нелигнифицированные, тонкостенные. Последним наносят 100% спирт, но если для обезвоживания используют 5-20% карбол-ксилол (смесь фенола с ксилолом), а это чаще всего, то его наносят после 96% спирта, минуя промывку в абсолютном спирте. Эта смесь обладает прекрасным просветляющим и обезвоживающим свойствами, продолжительность выдержки в ней зависит от интенсивности окраски. Убрав бумагой карбол-ксилол, срезы заливают ксилолом. В течение всей дифференцировки (проводки) после каждого погружения осторожно препаровальной иглой корректируют положение срезов на предметном стекле, чтобы они оказались в средней части. Не следует допускать подсыхания срезов, т.к. они свертываются в трубочку.

Трудно рекомендовать время выдержки срезов в каждом из реактивов, т.к. это зависит от толщины среза, характера объекта. Если в процессе дифференцировки срезы плохо обезвожены, они помутнеют при погружении их в ксилол. На прокрашенные и обезвоженные срезы наносят канадский бальзам и закрывают покровным стеклом, опуская его под некоторым углом к предметному стеклу, что способствует удалению воздуха. Количество наносимого бальзама устанавливают в процессе работы, и оно зависит от толщины среза, величины покровного стекла. Важно, чтобы все срезы были закрыты, покровное стекло полностью прилегало к предметному, и бальзам не вытекал в избытке.

После подсыхания в течение нескольких дней препарат маркируют или карандашом по стеклу, или наклеивают этикетку (при изготовлении учебных препаратов фабричным способом). Нельзя препараты держать на сильно освещенных местах, так как они выцветают.

Многие растения (лимонник, липа, пихта, актинидия и др.) содержат многочисленные слизевые идиобласты. Слизь затрудняет работу, т.к. срезы прилипают к фильтровальной бумаге и снять их без повреждения не удается. Избавиться от них можно кипячением в воде, но при этом мягкие ткани коры могут мацерироваться. Лучше заспиртованный материал (срезы) выдержать в 10%-ом водном растворе уксусно-кислого свинца, т.к. слизи теряют способность к набуханию.

4.7.3 Изготовление постоянных препаратов в глицерин-желатине

Этот способ изготовления постоянных препаратов используют в том случае, если хотят оставить неокрашенные препараты (эпидерма листа, мезофилл и т.д.). Окрашенные срезы в глицерин-желатине раскрашиваются. Это быстрый способ изготовления препаратов, причем некоторые структуры на них выявляются резче, чем неокрашенные.

Для приготовления глицерин-желатина берут 1 г желатина, 6 мл дистиллированной воды и 7 мл чистого глицерина. На 100 частей этой смеси добавляют 1 г карболовой кислоты (фенол). Сначала смачивают желатин в указанном количестве воды и оставляют набухать 2 часа, затем приливают глицерин и карболовую кислоту. Смесь при помешива­нии нагревают, пока желатин не растворится до равномерной консистенции. Затем сразу фильтруют через стеклянную вату с помощью воронки с двойными стенками, наполненной горячей водой. Можно пользоваться обычной воронкой, которую необходимо подогревать кругом, не давая ей остыть.

Для получения совершенно прозрачного желатина в теплый раствор глицерин-желатина рекомендуется добавить яичный белок, и нагреть до кипения, размешивая стеклянной палочкой. При этом белок свертывается, адсорбирует все примеси, обуславливающие муть. Глицерин-желатин нагретым надо профильтровать, но после этого мешать смесь ни в коем случае нельзя, т.к. образовавшиеся пузырьки воздуха будут попадать на препараты, а в отличие от канадского бальзама, из которого пузырьки воздуха очень хорошо исчезают, из глицерин-желатина они практически не удаляются. Хранить глицерин-желатин надо в колбе с широким дном, закрывая ее корковой пробкой, в которую через отверстие вставляют стеклянную палочку.

В комнатных условиях глицерин-желатин застывает, поэтому перед работой и в процессе изготовления препаратов его подогревают на водяной бане.

Объекты из мягких тканей в глицерин-желатине сжимаются, поэтому перед нанесением среза на предметное стекло, его сначала помещают в раствор глицерина с водой (1:9). Вода постепенно испаряется, и когда густота глицерина станет достаточной, срез помещают в глицерин-желатин под покровное стекло.

Срезы древесины такой процедуре не подвергают, а прямо из воды помещают под стекло. Избыток глицерина удаляют фильтровальной бумагой. Перед изготовлением предметное стекло слегка нагревают над спиртовкой, кладут срез, помещают на него несколько капель глицерин-желатина и накрывают покровным стеклом, опуская его постепенно на одно ребро наклонно. Тогда покровное стекло, опускаясь, вытесняет воздух. После опускания стекла его не прижимают и не надавливают (в отличие от помещения в канадский бальзам), не сдвигают. Для хранения препарата покровное стекло заключают в рамочку из канадского бальзама, расплавленного воска или парафина, перед этим удаляя выступивший из-под стекла глицерин-желатин.

4.7.4 Анализ препаратов

После изготовления препаратов, особенно при использовании канадского бальзама, им необходимо «подсохнуть». Ксилол, в котором растворяют канадский бальзам, испаряется, и покровное стекло прочно прикрепляется к предметному. Теперь необходимо произвести анализ объектов. Его характер зависит от целей исследования.

Если производится описание структуры нового объекта, о котором данных в литературе нет, то дают подробную его характеристику. Исследуя несколько срезов (они могут быть под одним стеклом), устанавливают общую картину структуры. Определяют гистологический состав объекта, топографию (расположение) тканей на разных срезах, их пара­метры, соотношение, наличие идиобластов и др.

Затем производят подробное описание, отмечая как общие, так и характерные особенности. Ткани описывают не в произвольном порядке, а в порядке их расположения в органе (в стебле – от центра к периферии, или наоборот; в листе от верхней стороны к нижней, или наоборот). Описание сопровождают количественными характеристиками, произво­дя замеры винтовым окуляр-микрометром, а если его нет, то мерной линейкой, вставляемой в окуляр. Предварительно определяют цену деления на всех увеличениях.

При описании тканей отмечают: