34.Понятие о культурах тканей.

кт – участки клеточного роста в спец пит среде ин витро. Можно получить из любого органа и ткани животного и человека, поэтому можно не исп дорогостоящ лаб и естественно восприимч животных. Исп органы молодых жив-х и эмбрионы, тк вирусы лучше размножаются в молодых и интенсивно раст орг.

Цели: выделение вирусв из патмат, поддерж вир в усл лаб, наработка вакцин, биомодель для пост РН и РГАд, титрование вирусов, изуч взаимод вируса с клеткой.

Требования: макс стерильность, пасуда нейтральная, поддерж и ростовые среды (в составе – ср Игла, 199, р Хенкса, гидролизат лактатальбумина; в ростовой – сыв крови; индикатор фенолрот: красный цве – пш среды нейтральна, жёлтая мутная – бакпророст, жёлтая прозрачная – гибель клеток, малинов – зещелач посуда)

Классификация: Переживающие, Растущие (плазменные, монослойные: первично-трипсинизир, субкультуры, диплоидные, перевиваемые)ю

Техника приготовления: Переживающие: готовят из орг и тк, кот измельч, отм от ФЭК ФБР, залив в спец пит среду, клетки во взвеш сост (Живые, но тер спос к пролиферации). Исп редко, против ящура)

Растущие:

1 Плазменные: орг и тк измельч, отм от ФЭК ФБР, во флакон внос плазму крови кур, пинцетом расп клетки в виде островков, для прикрепл – экстракт из кур эмбр (плазма сворачивается) или подогр дно до 45 град, залив рост среду, пом в термостат при т 37, через 2 суток – рост в виде пучков.

2 Монослойные : расп в 1 слой. В частности:

1.Первично трипсинизирванные: из люб орг и тк, 9-10 сут эмбриона, измельчают, отмыв от ФЭК ФБР, центрифугир (Ц), к осадку – 0, 25% трипсин, на магнитн мешалку на 30 мин при т 37. Трипсин расщипл кусочки тканей на отд клетки. Фильтруют через марлю, Ц в ФБР, р удаляют, осадок развод рост средой, доводя конц клеток до 40-80 тыс в 1 мл при пом кам Горяева. Клетки разлив по флаконам

2.Субкультуры получ из перв трипс. Удал рост среду, сним монослой при пом р-ра версена, отмыв от р-ра путём Ц, к осадку доб трипсин, далее см. перв трипсин.

3 Диплоидные: из перв трипс путём многократн пересевов на пит сред, клетки сохр жизнеспособн в теч 10 мес, потом – дегенерат измен и гибель

4.Перевиваемые: из опухол или дипл после обр УФЛ и ультразвуком, дипл приобр св-ва злокач опухолей.

35.Превично-трипсинизированные кт. Цпд вирусов.

Первично трипсинизирванные: из люб орг и тк, 9-10 сут эмбриона, измельчают, отмыв от ФЭК ФБР, центрифугир (Ц), к осадку – 0, 25% трипсин, на магнитн мешалку на 30 мин при т 37. Трипсин расщипл кусочки тканей на отд клетки. Фильтруют через марлю, Ц в ФБР, р удаляют, осадок развод рост средой, доводя конц клеток до 40-80 тыс в 1 мл при пом кам Горяева. Клетки разлив по флаконам.

ЦПД : после формирования монослоя удал рост среду, внос поддерж и доб вирус, помещ в термостат. Или с целью устран токсичности вируссод мат сначала могут внести вирус, ост на 1-2 часа, удалить вирус и внести поддерж среду. Флаконы – в термостат, кажд день – микроскопия под мал увел. через 2-3 суток в монослое обр пустоты, связ с ЦПД вируса. Флакон вынимают из термостата, удал поддерж среду, помещ в морозильн кам, где они сохр. При необходимости получ вируса флаконы 3 раза замор и размораж, доб ФБР и Ц, вирус – в надосад жидкости.