Лаб зош-Біохімія-Мінер обм-Віт-Горм-Ферм
.pdf21
Реактиви: 10 % розчин олії в хлороформі, 10 % розчин риб'ячого жиру в хлороформі, 1 % розчин феруму хлориду, концентрована H2SO4.
1.1. Проба з ферумом хлоридом Хід роботи. В одну пробірку наливають розчин риб'ячого жиру
в хлороформі, в другу – розчин олії в хлороформі i добавляють по декілька крапель розчину феруму хлориду.
При наявності вiтамiна А розчин забарвлюється в яскравозелений колір.
Висновки:___________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
__________________________________
1.2. Проба з сірчаною кислотою
Хід роботи. В одну пробірку наливають розчин олii в хлороформі, в другу – розчин риб'ячого жиру в хлороформі i добавляють по 1-2мл концентрованої сiрчаноi кислоти. При наявності вiтамiна А з'являється синє забарвлення, яке поступово переходить в фіолетове, а потім – в червоно-буре.
Висновки:___________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
__________________________________
2. Якісні реакцiї на вітамін Е 2.1. Проба з азотною кислотою
Вітамін Е з концентрованою азотною кислотою окиснюється з утворенням о-хінону, забарвленого в червоний колір.
Обладнання та матеріали: штатив з пробірками, піпетки, гумові груші, водяна баня.
Реактиви: концентрована азотна кислота, олійний розчин вітаміну Е.
Хід роботи. У дві пробірки наливають по 2-3 краплі олійного розчину вітаміну Е. В першу пробірку додають 1-2 мл води, у другу –
22
таку ж кількість концентрованої азотної кислоти. Обидві пробірки нагрівають на киплячій водяній бані 10 хв. У пробірці з азотною кислотою олійний розчин вітаміну забарвлюється у червоний колір.
Висновки:___________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
__________________________________
3.Якісні реакцiї на вітамін К
Улужному середовищі вітамін К гідролізується з утворенням фтіоколу, який взаємодіє з диетилмалоновим етером
С2Н5ОС – СН2 – СОС2Н5 Продукт конденсації диетилмалонового етеру з карбонільними
групами фтіоколу забарвлений у червоно-фіолетовий колір. Обладнання та матеріали: штатив з пробірками, піпетки,
гумові груші.
Реактиви: спиртовий розчин вітаміну К, 1 %-й спиртовий розчин диетилмалонового етеру, 1 %-й розчин КОН.
Хід роботи. У пробірку наливають 2 мл розчину вітаміну К, додають 1 мл розчину диетилмалонового етеру і 0,2 мл розчину КОН. У
пробірці з’являється червоно-фіолетове забарвлення.
Висновки:___________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
__________________________________
Дослідження водорозчинних вітамінів
1.Якісна реакція на вітамін В1 (тіамін)
Улужному середовищі тіазоловий цикл вітаміну стає нестійким
ілегко гідролізується з утворенням реакційноздатної сполуки – тіамін-тіолу. Тіамін-тіол взаємодіє з діазобензолсульфоновою кислотою (діазореактив) з утворенням сполуки, забарвленої у жовторожевий колір.
Обладнання та матеріали: штатив з пробірками, піпетки, гумові груші.
23
Реактиви: свіже цільне молоко, 0,001 %-й водний розчин вітаміну В1, 5%-й розчин NaOH, розчин А (0,9 г сульфонілової кислоти розчинюють у 9мл концентрованої HCl у мірній колбі ємкістю 100 мл і через деякий час доводять водою до мітки. У темній склянці розчин зберігається тривалий час), розчин Б (5 %-й розчин свіжевиготовленого азотистокислого натрію), діазореактив (у мірну колбу ємкістю 50 мл, занурену у посудину з льодом, відмірюють 1,5 мл розчину А і невеликими порціями додають 7,5 мл розчину Б, охолодженою у льду водою доводять об’єм розчину до мітки).
Хід роботи. У пробірці змішують 2 мл розчину NaOH і 3 мл діазореактиву. Половину отриманої суміші відливають в іншу пробірку. У пробірку 1 додають 1-2 мл розчину вітаміну В1, у пробірку 2 – 1-2 мл молока. У пробірках розвивається жовто-рожеве забарвлення.
Висновки:___________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
__________________________________
2. Якісна реакція на вітамін В2 (рибофлавін)
Реактиви: Екстракт дріжджів або висівок, 1 та 5 % розчини K3[Fe (CN)6 ], 10 та 30 % розчини NaOH, iзобутиловий спирт, концентрована HCl, металічний цинк, 10 % розчин тiосечовини, 2 та
10 % розчини HCl, 1 % розчин FeCl3, 0,001 н розчин 2,6-
дихлорфенолiндофенолу.
Хід роботи. В пробірку наливають 10 крапель вітаміну В2, додають 5 крапель концентрованої соляної кислоти i занурюють маленький шматочок металічного цинку. Починається виділення бульбашок водню, рідина з жовтого забарвлення поступово рожевіє, а потім знебарвлюється.
Висновки:___________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
__________________________________
3. Якісна реакція на вітамін В5 (вітамін РР, нікотинамід)
24
Під дією гідросульфіту натрію проходить часткове відновлення нікотинаміду (нікотинової кислоти) з утворенням 1,4- дигідропіридинпохідного, забарвленого у жовтий колір.
Обладнання та матеріали: штатив з пробірками, піпетки, гумові груші.
Реактиви: нікотинова кислоти чи амід нікотинової кислоти (порошок), 10 %-й розчин NaHCO3, 5 %-й розчин натрію гідросульфіту ( Na2S2O4 • 2Н2О).
Хід роботи. У пробірку поміщають невелику кількість порошку вітаміну В5 нікотинової кислоти чи її аміду, додають 1-2 мл розчину натрію гідрокарбонату і після додають 1-2 мл розчину натрію гідросульфіту. Рідина у пробірці забарвлюється у жовтий колір.
Висновки:___________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
__________________________________
4. Якісна реакція на вітамін С (аскорбінова кислота)
Хід роботи. До 5 крапель вітаміну С додають одну краплю 10 % розчину NaOH i одну краплю 5 % розчину K3 [Fe (CN)6 ]. Змішують i доливають 3 краплі 10 % розчину HCl i одну краплю 1 % розчину FeCl3. Випадає осад берлiнськоi лазурі.
Для контролю виконують цю саму реакцію, додаючи замість розчину вітаміну С дистильовану воду. В цьому випадку берлінської лазурі не утворюється.
Висновки:___________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
__________________________________
5. Кількісне визначення вітаміну С Принцип методу полягає в тому, що вітамін С, окиснюючись
відновлює 2,6-дихлорфенолiндофенол, який при цьому перетворюється в безбарвну сполуку.
Хід роботи. Зважують 20 г досліджуваної речовини (яблука, хрону, картоплі), подрібнюють, розтирають у фарфоровій ступці з 20 мл 2 % розчину HCl. Після цього вміст переносять у мірний циліндр,
25
ополіскують тим же розчином і доводять до об'єму 40 мл. Суміш фільтрують. Відміряють 10 мл фільтрату в склянку i титрують 0,001 н розчином 2,6-дихлорфенолiндофенолу до рожевого забарвлення, що не зникає протягом 30 сек. Кількість вітаміну С обчислюють за формулою:
CХ 0,088 20мг%, де:
С– кількість вітаміну С в 100г речовини;
Х – кількість мл 0,001 н 2,6-дихлорфенолiндофенолу, затрачена на титрування;
0,088 - кількість вітаміну С еквівалентна 1 мл індикатора; 20 – коефіцієнт переведення на 100 г досліджуваної речовини.
Висновки:___________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
__________________________________
6. Кількісне визначення рибофлавіну в крові Принцип методу. Рибофлавін в природних об'єктах
знаходиться у вільному стані та зв'язаний з білками, чи у складі флавінових коферментів. У більшості випадків рибофлавін перебуває у зв'язаній формі. Зв'язані з білком форми рибофлавіну не флуоресціюють. Для розриву зв'язку з білками і вивільнення рибофлавіну з коферментів необхідний кислотний гідроліз і обробка ферментними препаратами. Визначення рибофлавіну засноване на здатності його окисненої форми до флуоресценції при довжині хвилі збудження 430нм і випромінювання 565нм. Інтенсивність флуоресценції кількісно вимірюється флуорометром.
Мета роботи. Освоїти методику флуорометричного визначення вітаміну В2 в крові та ікрі риб. Поглибити знання про природні джерела рибофлавіну та його участь у метаболізмі.
Обладнання та реактиви. Фотоелектроколориметр. Центрифуга. Широка пробірка. Оксалатна кров, ікра риби. Розчин трихлороцтової кислоти (ω=10%). Розчин К2НРО4 (с(1/2)=4,0М). Дистильована вода. NаНСО3 і Na2S2O4 кристалічні.
26
Хід визначення рибофлавіну в крові. Оксалатну кров зразу після відбору об’ємом 2мл вносять у широку пробірку, туди ж додають 18мл розчину трихлороцтової кислоти (ω =10%), ретельно перемішують і залишають стояти в темряві протягом однієї години. Потім центрифугують, прозору надосадову рідину залишають при кімнатній температурі на дві доби для гідролізу. Потім нейтралізують кислоту, додаючи розчин К2НРО4 (с=4,0 М) з розрахунку 1мл розчину калій гідрофосфату на 4мл гідролізату. Доводять об’єм отриманого розчину дистильованою водою до 25мл. Далі 10мл витяжки вміщують у кювету флуорометра і вимірюють інтенсивність флуоресценції, використовуючи первинний світлофільтр з пропусканням світла в межах довжин хвиль 350-480 нм і вторинні світлофільтри з λ=510650нм. У іншу кювету вносять 10мл робочого стандартного розчину рибофлавіну і визначають інтенсивність його флуоресценції.
Для приготування стандартного розчину рибофлавіну 10мг розтертого в ступці рибофлавіну розчиняють у дистильованій воді в мірній колбі на 250мл (1мл такого розчину містить 0,04мг або 40мкг рибофлавіну). Цей основний розчин може зберігатися протягом місяця на холоді в темряві. З основного розчину безпосередньо перед визначенням кожного разу готують робочий розчин: 1мл основного стандартного розчину вносять у мірну колбу на 100см3 і доводять водою до риски. В 1мл робочого розчину міститься 0,4 мкг рибофлавіну.
Після визначення інтенсивності флуоресценції дослідного і стандартного розчинів рибофлавіну в обидві кювети вносять на кінчику шпателя кристалічні NаНСО3 і Na2S2O4 для гасіння флуоресценції рибофлавіну і знову вимірюють інтенсивність флуоресценції. При цьому в стандартному розчині флуоресценція повинна гаситися до нуля, але здебільшого до 5-6, а в досліджуваних витяжках залишається флуоресценція, яка обумовлена сторонніми флуоресціюючими речовинами незважаючи на проведену обробку. Гасіння флуоресценції рекомендується проводити два рази, так як воно відбувається повільно Для цього до взятих на вимірювання
27
флуоресценції проб повторно додають NаНСО3 і Na2S2O4 і знову вимірюють флуоресценцію розчинів. Вміст рибофлавіну в досліджуваній крові розраховують за формулою:
x (A B) 
m
V 
100, де (C C0 ) V1
x – вміст рибофлавіну в крові, мкг%;
A – інтенсивність флуоресценції досліджуваного розчину;
B - інтенсивність флуоресценції досліджуваного розчину після гасіння флуоресценції рибофлавіну;
C - інтенсивність флуоресценції стандартного розчину рибофлавіну; C0 - інтенсивність флуоресценції стандартного розчину рибофлавіну після гасіння флуоресценції;
m – вміст рибофлавіну в 1см3 робочого стандартного розчину, мкг; V – загальний об’єм вітамінного екстракту, мл;
V1 – об’єм крові, взятий для дослідження, мл.
Висновки:___________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
__________________________________
Завдання і вправи до розділу «ВІТАМІНИ»
1. Наведіть схему перетворень вітаміну А у зоровому процесі.
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
28
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________
2.Наведіть рівняння реакції, що розкриває механізм участі убіхінону в окисно-відновних процесах в організмі.
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________
3.Складіть схему окиснювального декарбоксилювання піровиноградної кислоти. Які коферменти беруть участь у цьому процесі? Напишіть формули цих коферментів.
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
29
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
______
Роботу прийнято____________________(підпис викладача)
30