Лаб зош-Біохімія-Мінер обм-Віт-Горм-Ферм

11

Вміст кальцію у сироватці крові деяких видів тварин у нормі (в

мг%):

ВРХ – 8 – 14, коні – 10 – 12, свині – 10 – 14, вівці – 10 – 12,5, кролі – 12, кури – 8 – 12, щурі – до 16.

5.Визначення фосфору методом Фіске-Суббароу

5.1.Визначення фосфору в біологічних рідинах Принцип методу. Фосфорна кислота взаємодіє в кислому

середовищі з ванадатом i молiбдатом амонію з утворенням фосфорнованадiєвомолiбденової кислоти жовтого кольору. Концентрацію неорганічного фосфору в сироватці крові або сечі визначають після осадження білків. Визначення ліпоїдного фосфору проводять по осаду після його мінералізації.

Реактиви: еталонний розчин фосфору – 5 ммоль/л; кислота трихлороцтова 1,47 моль/л; амонію молiбдат - 30 моль/л; амонiя ванадат – 2 моль/л.

Приготування робочих розчинів

а) Розчин 1. 50 мл трихлороцтової кислоти змішують з 70 мл дистильованої води. Розчин стійкий.

б) Розчин 2. (для визначення неорганічного фосфору). 1 долю розчину амонію ванадату змішують з однією долею розчину амонію молiбдату. Розчин зберігають в поліетиленовій посудині. Щоденно готують свіжий розчин 2.

в) Розчин 3. (для визначення ліпоїдного фосфору). В 50 мл амонію молiбдату розчиняють 0,2 г гідроксиду натрію. Одержану суміш змішують з ванадатом амонію у співвідношенні 1:1. Щоденно готують свіжий розчин 3.

г) Калiбрувальний розчин. Еталонний розчин фосфору i розчин 1 розбавляють дистильованою водою в співвідношенні 1:1.

Розчин містить 2,5 ммоль/л фосфору. При кімнатній температурі розчин стійкий протягом декількох тижнів.

Проведення аналізу. Довжина хвилі (380-410) нм, кювета 1 см.3

12

Перемішують i через 5 хв. пробу центрифугують протягом 10 хв. при

3000 об/хв.

Перемішують i через 20 хв вимірюють оптичну густину дослідної проби (А) i розчину порівняння (А1) проти контрольного розчину.

Висновки:___________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

__________________________________

5.2. Визначення ліпоїдного фосфору

До осаду після осадження білків добавляють 0,50 мл мiнералiзацiйної суміші (2 мл Н2О + 16 мл хлорної кислоти 70 % + 2 мл азотної кислоти 65 %), скляну кульку i обережно нагрівають на водяній бані до тих пір, поки осад не відділиться від дна. Потім вмiстиме пробірки нагрівають до помірного кипіння до тих пір, поки розчин не знебарвиться i не з'явиться білий дим хлорної кислоти. Розчин залишають охолонути, потім додають 2,50 мл розчину 3, 2,00 мл дистильованої води i перемішують. Через 5 хв. вимірюють оптичну густину проби (А) проти контрольного розчину (0,20 мл мiнералiзацiйної суміші i 2,50 мл розчину 3 змішують з 2,30 мл дистильованої води). Розчин порівняння готують так само, як описано вище при визначенні неорганічного фосфору (А).

Висновки:__________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

_________________________________________

6. Визначення фосфору експрес - методом

13

Принцип методу. Метод оснований на утворенні фосфорномолiбденової кислоти, яка з ейконогеном (1-аміно-2-нафтол- 4-сульфоновою кислотою) дає синє забарвлення.

Реактиви:

1.Амоній молiбденовокислий. Розчиняють 25 г в 1 л дистильованої води (розчиняють при t 60-80 С)

2.5 н розчин сірчаної кислоти. До 650 мл дистильованої води обережно доливають 112,5 мл концентрованої сірчаної кислоти.

3.Розчин ейконогену. (1,2,4-амiнонафтолсульфонова кислота). Беруть

15 г NaHSO4 i 0,5 г Na2 SO4 i розчиняють в 50 мл дистильованої води. В цей розчин вносять 0,25 г ейконогену i доводять водою до 100 мл. Перед використанням розчин розводять дистильованою водою у співвідношенні 1:4. Обидва розчини зберігають в темній

скляній посуді.

4. Стандартний розчин фосфору. Беруть 350,9 мг KH2PO4 i 20 мл 0,1 н розчину сiрчаноi кислоти, доводять дистильованою водою до 1 л. В 5 мл цього розчину мiститься 0,4 мг фосфору або в 1 мл 0,08 мг. Розчин придатний тривалий час.

5. 22 % розчин ТХО кислоти.

6. Фізіологічний розчин.

7.Пергідроль.

8.Концентрована, хімічно чиста сірчана кислота.

9.Свіжеприготована перед використанням суміш рівних об’ємів першого i другого реактивів.

Хід аналізу

Визначення неорганічного фосфору.

В центрифужну пробірку вносять 2 мл фізіологічного розчину, додають 1мл цiльної крові або плазми, 1 мл 22 % розчину ТХО, збовтують i через 10 хв. центрифугують. Потім 2 мл центрифугату крові (відповідає 0,5 мл крові) переносять в чисту суху пробірку i доливають 2 мл свiжеприготовленої суміші першого i другого реактивів, а потім 1 мл розведеного розчину ейконогену i доводять об'єм до 5 мл. Пробірку ставлять на водяну баню на 5 хв при t 370 С.

Охолоджують у воді при кімнатній температурі i колориметрують на ФЕК з червоним фільтром в кюветах з робочою довжиною 1 см.

Визначення загального фосфору.

В мiкрокельдалiвську колбу вносять 0,05 мл цільної крові, додають 0,2 мл 5 н сірчаної кислоти i мінералізують до повного знебарвлення. Потім кількість фосфору визначають так, як вказано вище.

Визначення кислоторозчинного фосфору

14

Беруть 0,25-0,5 мл трихлороцтового фільтрату, отриманого, як вказано для неорганічного фосфору, переносять в мiкрокельдалiвську колбу, мінералізують i визначають фосфор аналогічно неорганічному.

Розрахунок. Кількість фосфору визначають по попередньо побудованій калiбровочнiй кривій. Із основного стандартного розчину фосфорно-кислого калію готують серію розведень від 0,016 до 0,048 мг фосфору в 5 мл розчину, які обробляють i колориметрують аналогічно дослідним пробам. Показання прилада фіксують на міліметровий папір по осі ординат, а по осі абсцис наносять вміст фосфору в міліграмах.

Висновки:___________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

__________________________________

7. Кількісне визначення хлоридів у крові Принцип методу. Хлорид–іони утворюють з аргентум–іонами

малорозчинний аргентум хлорид. Розчинність AgCl у воді складає 1·10-5 М. Для визначення йонів Cl– в біологічних об’єктах цим методом необхідно звільнити їх від білків, вуглеводів, які теж можуть зв’язувати йони Ag+. Безбілковий фільтрат крові титрують розчином аргентум нітрату (c=0,01М) за наявності у досліджуваному розчині калій хромату як індикатора. Розчинність Ag2CrO4 у воді складає 7·10- 5 М. При титруванні розчину, в якому містяться йони Cl– і CrO42–, спочатку буде утворюватись осад білого кольору AgCl. Після відтитрування йонів Cl– навіть зайва крапля розчину AgNO3 призведе до утворення осаду Ag2CrO4 цегляно – червоного кольору.

Мета роботи. Освоїти методику визначення хлоридів у крові. Поглибити знання про роль Хлору у життєдіяльності тварин.

Обладнання та реактиви. Водяна баня. Пробірки. Фільтр. Розчин цинк сульфату (ω=0,45%). Розчин натрій гідроксиду (c=0,1М). Розчин калій хромату (ω=5%). Розчин аргентум нітрату (c=0,01М). Кров. Дистильована вода.

Хід роботи. У дві пробірки (дослідну і контрольну) вносять по 5мл розчину цинк сульфату (ω=0,45%) і по 1мл розчину натрій гідроксиду (с=0,1М). Потім у першу пробірку вносять 0,1мл крові. Обидві пробірки ставлять у киплячу водяну баню на 3хв. При цьому в

15

першій пробірці осаджуються білки, а в обох пробірках ще утворюється малорозчинний цинк гідроксид.

Вміст обох пробірок фільтрують, осади на фільтрах промивають два рази по 5 мл дистильованої води. До фільтратів додають по дві краплини розчину калій хромату (ω=5%) і титрують розчином аргентум нітрату (с=0,01М) до появи ледь помітного цегляно– червоного кольору.

Розрахунки вмісту йонів Cl– у крові розраховують за формулою:

С – концентрація хлорид–іонів у крові, мМ;

V1 – об’єм розчину аргентум нітрату (с=0,01М), який затрачено на титрування дослідної проби, мл;

V2 – об’єм розчину аргентум нітрату (с=0,01М), який затрачено на титрування контрольної проби, мл;

V3 – об’єм крові, взятої для аналізу, мл;

Т – титр розчину аргентум нітрату (с=0,01М) за хлорид–іоном, мг/мл

(Т=0,355мг/мл);

mМ – мілімолярна маса хлоридіона (35,5 мг/моль).

Висновки:___________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

__________________________________

Завдання і вправи до розділу «МІНЕРАЛЬНІ РЕЧОВИНИ»

1. Йон якого металу:

а) необхідний для перетворення D-молочної кислоти у піровиноградну за участі лактатдегідрогенази;

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

__________________________________________

16

б) сприяє активації вищих жирних кислот при взаємодії їх з АТФ і КоА за наявності ацил-КоА-синтетази;

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

__________________________________________

в) активує фосфоліпазу с, яка каталізує реакцію гідролізу фосфатидилхоліну і діацилгліцеролу;

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

__________________________________________

г) є незамінним у реакції ферментативного окиснення фенілаланіну в тирозин?

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

________________________________________________________

2. Обґрунтуйте твердження:

а) приєднання флавінового коферменту до апоферменту здійснюється за участі йонів Феруму, Молібдену, Купруму, Цинку;

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

17

____________________________________________________________

__________________________________________

б) Сu2+ є інгібітором енолази і піруваткінази.

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

__________________________________________

3. З якою метою використовують атомно-адсорбційний спектральний аналіз?

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

________________________

Роботу прийнято ______________________(підпис викладача)

18

19

20

Дата “______” _________________20____р.

Тема ВІТАМІНИ

Контрольні питання (після вирішення яких студент допускається до виконання експериментальної частини заняття)

1.Які органічні сполуки називаються вітамінами? Класифікація вітамінів.

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

__________________________________________

2.Поясніть чому при додаванні у їжу переважно кукурудзи і невеликої кількості м’яса виникає пелагра – захворювання, яке обумовлено недостатністю нікотинової кислоти?

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

__________________________________________

3.В яких процесах приймає участь вітамін К?

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________

__________________________________________

Дослідження жиророзчинних вітамінів 1. Якісні реакцiї на вітамін А

Обладнання та матеріали: штатив з пробірками, піпетки, гумові груші.