16. Нуклеиновые кислоты и факторы наследственности у животных организмов.
Молекулярные основы наследственности составляют нуклеиновые кислоты – ДНК (у всех микробов, одноклеточных, растительных организмов, насекомых, животных) и РНК (у некоторых вирусов, в частности онкогенных). Именно в этих крупных биополимерах с помощью единого языка, алфавит которого составляют 4 буквы – нуклеозиды, записана генетическая информация живых существ. В ДНК информация изложена чередованием аденина (А), тимина (Т), гуанина (Г) и цитозина (Ц), которые образуют определенные последовательности, связываясь остатками дезоксирибозы и фосфором в одноцепочечных молекулу.
Потом два комплементарные друг другу цепи образуют водородные связи: аденин-тимин (AT) и гуанин-цитозин (ГЦ), которые закручиваются и образуют двойную спираль, преимущественно правовинтовую, одновременно биологическое и информационную, “змеиные лестница”). Молекула РНК имеет односпиральну структуру. В ее состав вместо тимина входит урацил (У), а вместо остатка дезоксирибозы – рибоза (химически несколько иная пентоза).
Молекула нуклеиновой кислоты (НК) имеет способность к размножению, удвоение или репликации. Размножаются, тиражируются не белки, а нуклеиновые кислоты. При наличии необходимых компонентов и соответствующих ферментов на матрице каждой нити двуспиральной ДНК (после их разъединения) синтезируется комплементарный цепь новой ДНК. Репликация должна полуконсервативной, матричный характер. В каждой двуспиральные молекуле содержится и материнский (старый), и дочерний (новый) цепь нуклеотидов.
При реализации генетической информации происходит декодирование: речь нуклеиновых кислот (четыре буквы А, Т, Г, Ц) должна быть переведена на язык белков (20 аминокислот, условно 20 букв). Это возможно благодаря кодовому принципу: одной аминокислоте соответствует запись из трех нуклеотидов в нуклеиновой кислоте. Например, последовательность аденин, аденин, аденин (ААА) кодирует фенилаланин, а АТТ – лизин. Поэтому генетический код – триплетных. Но с 4 букв (А, Т, Г, Ц) можно получить 64 различные комбинации по 3 буквы (43 = 64), а в природе существует только 20 аминокислот.
Другие триплеты (кодоны) – сочетание трех нуклеотидов – не лишние. Три из них (АТЦ АЦТ, АТТ) – они свидетельствуют о конце синтеза, знаки препинания (как в языке – точка, запятая и т.д.). Другие обеспечивают запас прочности генома, так кодирующих те же аминокислоты, что и основные триплеты. Поэтому генетический код – вырожденный: одна аминокислота может быть закодирована в ДНК 2-4 триплетами. В одном гене кодоны расположены друг за другом, как слова в предложении, не перекрываются, что упрощает запись и делает его стабильным.
Генетический код не перекрывается. У всех живых организмов на Земле в генетической программе те же триплеты кодируют те же аминокислоты. Признаки генетического кода - триплетный, вырожденный, не перекрывается, универсальный.
Важнейшая функция РНК - участие в процессе синтеза белков в клетке, ДНК - определение специфичности и передача единиц наследственности. РНК - информационная (несет информацию ДНК о первичной структуре белка), транспортная (транспортирует аминокислоты в рибосомы), рибосомная (образует рибосомы, собирает белки), ядерная (4-10% от общей). Подавляющая часть ДНК сосредоточена в ядре, в цитоплазме эукариот содержится менее 1 % всей ДНК клетки. ДНК эукариот почти вся находится в хромосомах ядер, лишь небольшое ее количество содержится в митохондриях, а у растений и в плазмидах. Суммарный материал хромосом - хроматин. Каждая хромосома состоит из центральной нити (хромонемы), вдоль которой расположены четкообразные структуры (хромомеры). Число хромосом колеблется от одной до 100, чаще 10-50. У эукариот хромосомы всегда парные, по две каждого сорта.
Наследственными факторами или единицами наследственности у живых организмов являются гены, которые лежат в хромосомах в линейном порядке.
Фундаментальные свойства наследственных факторов — генов:
1) наличие альтернативных наследственных факторов для развития каждого конкретного признака организма (в современном представлении доминантный и рецессивный аллели гена).
2) парность наследственных факторов, определяющих развитие признака (у диплоидного организма). Существенный вывод: наследуются не признаки, а от родителей к потомкам передаются вместе с гаметами гены. Из этих двух положений был развит принцип аллелизма.
3) Дискретность и относительное постоянство гена (в гибридной зиготе рецессивный аллель не сливается и не смешивается с доминантным аллелем и поступает в гамету F1 в чистом виде и, объединяясь с подобным аллелем при оплодотворении, проявляется как рецессивный признак в F2). Этот феномен в последующем получил название закон чистоты гамет.
17. Генная инженерия бактерий.
Генная инженерия - это совокупность методов, позволяющих посредством операций in vitro (вне организма) переносить генетическую информацию из одного организма в другой. Формальной датой рождения генной инженерии считают 1972 г. B этот год группа исследователей во главе с американским биохимиком Полом Бергом, работавшим в Стэнфордском университете, что неподалеку от Сан-Франциско в Калифорнии, сообщила о создании вне организма первой рекомбинантной ДНК.
Такую молекулу часто называют гибридной, так как она состоит из ДНК-фрагментов различных организмов. Первая рекомбинантная молекула ДНК состояла из фрагмента ДНК бактериофага кишечной палочки (Е. coli), группы генов самой этой бактерии, ответственных за сбраживание сахара галактозы, и полной ДНК вируса SV40, вызывающего развитие опухолей у обезьян.
Основные методы генной инженерии бактерий были разработаны в начале 70-х годов прошлого века. Их суть заключается во введении в организм нового гена. Наиболее распространенный из них - конструирование и перенос рекомбинантных ДНК. Этот метод включает несколько этапов.
Этап 1. Создание векторов. Для переноса нового гена в какую-либо клетку создают специальные генетические конструкции - векторы. Вектор - это молекула ДНК (реже РНК), способная самостоятельно реплицироваться в клетках и обеспечивать размножение и работу искусственно встроенного в нее какого-либо гена, не имеющего обычно собственных регуляторных элементов. Если говорить просто, то вектор - устройство для доставки нового гена в клетку, которую в этом случае называют реципиентной. В качестве векторов в генной инженерии используют плазмидную ДНК и ДНК бактериофагов.
Плазмиды. Плазмиды часто называют даром природы генным инженерам. Это кольцевые двухцепочные молекулы ДНК, размером от 2-3 до нескольких десятков тысяч пар нуклеотидов. Они достаточно широко распространены в природе. К полезным свойствам плазмид, позволяющим использовать их в генной инженерии, можно отнести следующие. Во-первых, плазмиды - это автономные генетические элементы, реплицирующиеся в бактериальной клетке независимо от ее основной молекулы ДНК. Во-вторых, они способны легко проникать из одной клетки бактерии в другую, например, в процессе конъюгации, что позволяет использовать их для переноса генетической информации. Несмотря на то, что на долю плазмид приходится лишь небольшая часть клеточной ДНК, именно они несут такие жизненно важные для бактерии гены, как гены устойчивости к антибиотикам.
Выделение плазмидной ДНК методом центрифугирования. Разработано несколько способов выделения плазмидной ДНК в чистом виде. Самый распространенный из них заключается в следующем. Сначала во взвесь бактериальных клеток добавляют вещества, разрушающие их оболочки. Клетки разрушаются, лизируются, и ДНК переходит в раствор. Лизис виден невооруженным глазом: мутная легкоподвижная жидкость превращается в прозрачную, вязкую. Получается смесь бактериальной и плазмидной ДНК, но судьбы их разные. Кольцевые хромосомы бактерий огромны, и получить их целыми очень сложно: они ломаются на линейные фрагменты. Кольца плазмидной ДНК много меньше, к тому же они компактно уложены (супер-скручены) и могут сохраняться целыми.
Бактериофаги. Помимо плазмид в качестве векторов используются бактериофаги, т.е. вирусы бактерий. Преимущество фагов как векторов - возможность получать большие фрагменты ДНК по сравнению с теми, которые могут переносить плазмиды. Чаще других для этой цели используют один из фагов кишечной палочки - фаг лямбда. Причин для этого несколько. Во-первых, ДНК этого фага сравнительно невелика, гены хорошо изучены, и он быстро размножается в клетках бактерий. Во-вторых, фаг может потерять до 25% своей ДНК, не утратив при этом способности формировать зрелые фаговые частицы и разрушать бактериальные клетки. И только если потеря превышает эту величину, фаг погибает. Кроме того, фагу все равно, какой ДНК «грузиться» - своей или чужой.
Этап 2. Получение гена для встраивания в вектор. Получение нужного гена - один из наиболее трудных этапов в работе генных инженеров. Для этого используют следующие методы:
• метод «дробовика», основанный на разрезании ДНК специальными ферментами (рестриктазами) и поиск фрагмента, содержащего нужный ген;
• получение копии гена на иРНК с помощью фермента обратной транскриптазы;
• искусственный синтез гена.
Этап 3. Встраивание гена в вектор. Используемые в качестве векторов плазмидная ДНК и фаговая ДНК «разрезаются» определенной рестриктазой с образованием однотяжевых «липких» концов. Той же рестриктазой обрабатывается до-норная ДНК, содержащая нужный ген. Образующиеся на ее фрагментах «липкие» концы оказываются комплиментарными нуклеотидным последовательностям на концах вектора. Этот процесс называют рестрикцией. Затем фрагменты ДНК, среди которых есть и тот, что содержит нужный ген, смешиваются с векторной ДНК. При смешивании они соединяются «липкими» концами. Например, «липкий» конец ААТТ соединится с комплиментарным «липким» концом ТТАА.
Этап 4. Введение рекомбинантной ДНК в клетку бактерии. На данном этапе рекомбинантную ДНК вводят в бактериальную клетку, в которой она сможет размножаться (клонировать себя и новый ген, который содержит). Обычно для этой цели используют бактерию Е. соН. Она быстро растет и в природных средах, и в кишечнике человека. Обычные, «дикие», штаммы Е. coli неприхотливы. Для них пригодна среда с глюкозой (источник углерода и энергии), фосфором (источник фосфора) и какой-либо солью аммония (источник азота). Все аминокислоты и нуклеотиды они синтезируют сами. Эта бактерия служит надежным хозяином для многих рекомбинантных ДНК и детально изучена генетически. Для генной инженерии получен специальный штамм кишечной палочки, выживающий только в особых лабораторных условиях.
Этап 5. Отбор трансформированных клеток и их клонирование. Учитывая, что рекомбинантные ДНК проникают лишь в часть обработанных клеток, трансформированные бактерии необходимо отделить от нетрансформированных. Для этого обычно используют метод селективных сред. Бактерии высевают на студнеобразной питательной среде с антибиотиком, предварительно разведя так, чтобы при рассеве клетки находились на значительном расстоянии друг от друга. Нетрансформированные бактерии погибают, а трансформированные, приобретя вместе с рекомбинантной ДНК устойчивость к определенному антибиотику, размножаются и образуют колонию из многих тысяч потомков - клон. Таким образом, клон - это все потомство одной бактерии, а процесс получения таких бактерий в результате бесполого размножения называется клонированием.
Этап 6. Скрининг. Если на первых этапах клонирования использовался метод «дробовика», то не все колонии трансформированных бактерий будут нести тот фрагмент ДНК, который содержит нужный ген. Это связано с тем, что донорная ДНК после рестрикции представляет собой смесь очень большого числа фрагментов, и нужный ген будет содержаться только в одном из них. Поэтому колонии (клоны) трансформированных бактерий подвергаются скринингу, т.е. отбору тех из них, ДНК которых содержит нужный ген.
18. Генная инженерия растений.
Гены, которые хотят перенести в растения, вшивают в векторы плазмид Е.сoli, затем гибридные ДНК переносят в агробактерии, а из них в растения. Предназначенный для переноса ген вшивают в участок плазмиды агробактерии, способный внедряться в ядро растительной клетки. Для переноса генов используют также вирусы растений, в частности вирус цветной мозаики капусты. Ряд генов вируса, несущественных для его жизнедеятельности, заменяются на другие гены.
Культуры клеток высших растений имеют две сферы применения:
1.Изучение биологии клетки, существующей вне организма, обуславливает ведущую роль клеточных культур в фундаментальных исследованиях по генетике и физиологии, молекулярной биологии и цитологии растений. Популяциям растительных клеток присущи специфические особенности: генетические, эпигенетические (зависящие от дифференцированной активности генов) и физиологические. При длительном культивировании гетерогенной по этим признакам популяции идет размножение клеток, фенотип и генотип которых соответствуют данным условиям выращивания, следовательно, популяция эволюционирует. Все это позволяет считать, что культуры клеток являются новой экспериментально созданной биологической системой, особенности которой пока мало изучены. Культуры клеток и тканей могут служить адекватной моделью при изучении метаболизма и его регуляции в клетках и тканях целого растения.
2. Культивируемые клетки высших растений могут рассматриваться как типичные микрообъекты, достаточно простые в культуре, что позволяет применять к ним не только аппаратуру и технологию, но и логику экспериментов, принятых в микробиологии. Вместе с тем, культивируемые клетки способны перейти к программе развития, при которой из культивируемой соматической клетки возникает целое растение, способное к росту и размножению.
Можно назвать несколько направлений создания новых технологий на основе культивируемых тканей и клеток растений:
1) Растения, устойчивые к насекомым. Для создания устойчивых к насекомым растений в их геном встраивают ген токсина, выделенный из Bacillus thuringiensis (этот микроорганизм вызывает болезни у чешуекрылых и развиваясь в организме насекомого, выделяет ВТ-токсин). Считается. Что токсин не оказывает действия на человека. Растения, способные к синтезу токсина, проявляют устойчивость к некоторым вредителям. Это позволяет снизить применение пестицидов на полях, что снижает загрязнение окружающей среды.
Наиболее безопасные проекты связаны с трансгенным хлопчатником, синтезирующим ВТ-токсин. Устойчивый к насекомым трансгенный рапс позволит получать техническое растительное масло с меньшими затратами и с меньшим вредом для окружающей среды (рапс сегодня - одна из наиболее химизированных культур). В качестве возможных следствий производства трансгенных пищевых растений, проявляющих устойчивость к насекомым, можно указать пищевую аллергию, которую может вызвать ВТ-токсн (новый белок в пище). К экологическим следствиям можно отнести возникновение устойчивости к ВТ-токсину, которое может происходить в популяциях насекомых-вредителей при широком применении трансгенных растений.
2) Улучшение качества пищевых продуктов. Многие растительные продукты содержат недостаточные количества незаменимых аминокислот и витаминов. Этот недостаток можно исправить, внедряя в растения гены, ответственные за биосинтез витаминов или модифицированные гены запасных белков, в которых чаще "употребляются" кодоны незаменимых для человека аминокислот (прежде всего - лизина). В настоящее время получены трансгенный рис с повышенным содержанием каротиноидов, трансгенная соя с улучшенным белковым составом.
В растительной пище могут содержаться вредные для здоровья вещевтва. Например, около 10% японцев страдают от аллергии на запасной белок зерновок риса. Генная инженерия позволяет получить рис, в котором "выключен" ген соответствующего белка. Такие трансгенные растения позволяют вернуть традиционный продукт в рацион аллергиков.
3) Улучшение товарных качеств. Изучение генетической регуляции развития цветка позволяет быстро создавать махровые сорта разнообразных декоративных растений, которые пользуются большим спросом на рынке. Кроме того, в растения можно ввести гены, отвечающие за синтез пигментов и получить необычную окраску (например, получены трансгенные петунии с цветками желтого цвета). Интересным представляется экспрессия втрансгенных растениях белков, светящихся в темное, или флуоресцирующих белков, что придаст растениям принципиально новые декоративные качества.
4) Растения, устойчивые к гербицидам. Одной из технологий, позволяющей удешевить процесс борьбы с сорняками, является получение гербицид-устойчивых культурных растений. По новой технологии обработку полей неселективными гербицидами можно проводить весь сезон, что улучшает результаты их применения, сокращает расходы. Не удивительно, что такие проекты и реклама трансгенных гербицид-устойчивых растений организуются при финансовой поддержке фирм-производителей гербицидов.
Данное направление генной инженерии таит ряд экологических опасностей. Главная из них возможное накопление гербицидов (или продуктов их детоксикации) в с/х продуктах. Если для технических культур это сравнительно безопасно, то использовать в пищу обработанные гербицидами трансгенные растения может оказаться опасным.
Вторая опасность - это "утечка" генов устойчивости к гербицидам из культивируемых растений в близкородственные растения естественных биоценозов. В Европе проблеме "генной безопасности" уделяют большое значение, поскольку на ее территории растет много видов, близких к культурным растениям. Показано, что признаки устойчивости могут переноситься при близкородственном опылении. "Утечка генов" может привести к возникновению "суперсорняков", устойчивых к применяемому гербициду, и технологию придется снова менять.
Третья опасность - передозировка гербицидов. Гербицид-устойчивость позволяет вносить избыток этих агентов на поля без видимого вреда для них (в традиционной технологи выращивания это невозможно - культурные растения погибнут вместе с сорняками). Уже сегодня многие гербициды признаны опасными для рыб, моллюсков и др. животных. Сток гербицидов с полей в водоемы с применением новой технологии, несомненно, усилится.
5) Повышение устойчивости растений. Для нашей страны актуально получение морозостойких сортов растений. Важно придать теплолюбивым культурам устойчивость к заморозкам. Основным повреждающим агентом при замерзании является кристаллический лед. Для предотвращения его образования некоторые рыбы и насекомые выделяют особые гидрофильные белки. Гены этих белков можно перенести в растения, и их морозостойкость повысится.
Устойчивость к засухе и засолению определяется сложным взаимодействием многих генов. Поэтому создание трансгенных растений, устойчивых к засухе/засолению представляется довольно сложной задачей. (Генная инженерия работает с отдельными генами, а не с большими комплексами генов).
6) Биосинтез инсулина, антител и др. белков для нужд медицины. Производство генно-инженерных белков в трансгенных клетках бактерий или дрожжей практикуется уже достаточно давно. Однако, возникает проблема правильной можификации таких белков в бактериальных или дрожжевых клетках. Часто белок так и не принимает нужной конформации или слегка отличается по аминокислотному составу, что нежелательно. Растения являются эукариотными органзмами, достаточно близкими к животным биохимически, поэтому было предложено получать белки для нужд медицины из трансгенных растений.
Поскольку организовать выращивание растений дешевле, чем выращивание бактерий или дрожжей, а получаемый пробукт будет более качественным, можно ожидать большого экономического эффекта от внедрения этой технологии. В медицинской практике используется не вся биомасса растения, а выделенный из нее индивидуальный компонент (белок), т.е. препарат проходит предвартельную очистку и должен быть безопасным для здоровья людей.