8. Фосфолипиды

Фосфолипиды – одна из важнейших групп жироподобных веществ, широко распространенных в клетках тканей животного организма. Они представляют собой высокомолекулярные сложные эфиры, в состав которых входят спирты разных классов, предельные и непредельные жирные кислоты, фосфорная кислота и азотистое основание.

В зависимости от азотистого основания и спирта их разделяют на следующие подгруппы: холинфосфолипиды (лецитины), коламинфосфолипиды (кефалины), серинфосфолипиды, ацетальфосфолипиды, сфингомиелины и инозитфосфолипиды. Первые четыре фосфолипида построены из спирта глицерина, остатков предельных и непредельных жирных кислот, фосфорной кислоты и какого-либо азотистого основания. Общая формула их следующая:

Фосфолипиды наряду с белками являются главными компонентами мембран клеток и их органелл (плазмалемма, митохондрии, цитоплазматическая сеть, пластинчатый комплекс, лизосомы и др.). Они принимают участие в обмене веществ (транспорт через мембраны, субстраты тканевого дыхания). Фосфолипиды корма и технические фосфатиды повышают коэффициент использования азотистых веществ и фосфора рациона животных.

Фосфолипиды различаются способностью растворяться в органических растворителях. Из клеток и тканей фосфолипиды лучше всего экстрагируются смесью хлороформа со спиртом. Большинство фосфолипидов плохо растворимо в ацетоне, что используется при препаративном выделении их из биологических объектов.

Удобными объектами для выделения и изучения химического состава фосфолипидов служит нервная ткань, яичный желток, печень, молоко, которых они присутствуют в значительном количестве.

1. Выделение лецитинов из яичного желтка

Техника определения: в стакан помещают половину яичного желтка, добавляют 20 см³ горячего спирта и перемешивают стеклянной палочкой. Смесь охлаждают и фильтруют в сухую пробирку. Если фильтрат раствор непрозрачный – фильтрование повторяют.

Для выявления в фильтрате лецитина в сухую пробирку наливают 5 см³ ацетона и к нему каплями добавляют полученный фильтрат. Появление мути свидетельствует об осаждении лецитина.

В другую сухую пробирку наливают 3 см³ фильтрата и добавляют к нему каплями воду. Образуется стойкая эмульсия. Остальной фильтрат используют для других реакций на лецитины.

Материалы, реактивы и оборудование: яичный желток, спирт этиловый, 96 %-й, ацетон, химический стакан, штатив с пробирками, воронки, фильтры бумажные, палочка стеклянная.

2. Гидролиз лецитина и определение продуктов гидролиза

При нагревании со щелочью лецитин расщепляется на глицерин, высшие жирные кислоты, фосфорную кислоту и холин. Продукты гидролиза лецитина можно обнаружить с помощью ряда реакций.

Техника определения: в пробирку наливают 5 см³ спиртового раствора лецитина, 3 см³ 10 %-го гидроксида натрия и кипятят в течение 5 минут. Холин, отщепившийся в результате гидролиза, в щелочной среде распадается с образованием триметиламина. Последний – обладает запахом селедочного рассола и легко обнаруживается по этому признаку.

Обнаружение высших жирных кислот

Техника определения: полученный щелочной гидролизат разбавляют 2 см³ воды и к нему по каплям добавляют 10 %-й раствор соляной кислоты до выделения свободных жирных кислот, которые всплывают в виде жидкого слоя. Выделяющиеся жирные кислоты отфильтровывают.

Прозрачный фильтрат нейтрализуют 10 %-м раствором гидроксида натрия при наличии фенолфталеина до слабой розовой окраски и упаривают на водяной бане досуха. В сухом остатке устанавливают присутствие глицерина и фосфорной кислоты.

Обнаружение глицерина

Техника определения: половину сухого остатка переносят в другую пробирку, добавляют 0,5 г гидросульфата калия и смесь нагревают на пламени горелки, держа пробирку горизонтально. При этом ощущается резкий, характерный запах акролеина.

При нагревании жира в присутствии водоотнимающих реагентов, в частности гидросульфатов калия или натрия, от глицерина легко отщепляются две молекулы воды и он превращается в непредельный альдегид акролеин:

Акролеиновую реакцию проводят с целью открытия свободного глицерина или связанного в молекуле жира. Липиды, не содержащие глицерина (воска, стериды, инозитфосфолипиды), дают отрицательную реакцию на акролеин.

Обнаружение фосфорной кислоты

Техника определения: вторую половину остатка сплавляют в тигле с небольшим количеством нитрата калия и карбоната натрия (1:2) до полного обесцвечивания смеси. Затем тигель охлаждают и содержимое его растворяют в 2 см³ концентрированной азотной кислоты. Раствор из тигля сливают в пробирку, добавляют двойной объем молибденового реактива и нагревают. Образование желтого осадка фосфоромолибдата аммония указывает на присутствие в растворе фосфорной кислоты:

Обнаружение азота

Принцип метода: при прокаливании азотосодержащего органического вещества с металлическим натрием образуется цианид натрия, который с гидроксидом железа (II) дает гексациано-(II)-феррат натрия.

Это вещество при взаимодействии с солями оксида железа (III) образует синий осадок комплексного цианида – берлинской лазури:

Техника определения: в сухую пробирку помещают небольшое количество лецитина вместе с кусочками металлического натрия и осторожно прокаливают на пламени горелки до полного разложения. Раскаленную пробирку опускают в стакан с 5 см³ дистиллированной воды. Пробирка лопается, содержимое ее растворяется в воде. Раствор фильтруют в пробирку, прибавляют к фильтрату 3 капли 1 %-го раствора сульфата железа (II) и кипятят 2 минуты. После охлаждения смеси в пробирку добавляют по 3 капли 1%-го раствора хлорида железа (III) и 10 %-го раствора соляной кислоты. В пробирке выпадает синий осадок берлинской лазури. Если в исходном материале было мало азота, то раствор окрашивается в зеленый цвет, а синий осадок выделяется спустя некоторое время.

Материалы, реактивы и оборудование: спиртовой раствор лецитина, гидроксид натрия 10 %-й раствор, соляной кислоты 10 %-й раствор, гидросульфат калия кристаллический, фенолфталеин 0,1 %-й раствор, нитрат калия кристаллический, карбонат натрия кристаллический, азотная кислота концентрированная, молибденовый реактив (приготовление: 7,5 г. молибдата аммония растворяют в 100 см³ воды и добавляют 100 см³ 32 %-го раствора азотной кислоты), натрий металлический, сульфат железа (II) 1%-й раствор, хлорид железа (III) 1 %-й раствор, пробирки, воронки, фильтры бумажные, баня водяная, стеклянная палочка, химический стакан.