7. Определение эфирного числа

Эфирным числом называют количество миллиграммов гидроксида калия, необходимого для нейтрализации освобождающихся при омылении эфирных связей жирных кислот в 1 г масла. Оно характеризует содержание связанных в виде эфиров жирных кислот в масле.

Экспериментальное эфирное число (ЭЧ) определяют по разности между числом омыления и кислотным числом.

8. Окислительное прогоркание жиров

Наиболее распространенным видом порчи жиров в процессе хранения является окислительное прогоркание, при котором происходит накопление продуктов окисления, снижение пищевой ценности и ухудшение органолептических показателей.

Процесс окисления может проходить неферментативным (химическим) и ферментативным (биохимическим) путем.

Жиры и масла, особенно содержащие остатки ненасыщенных (арахидоновой, линоленовой, линолевой, олеиновой) жирных кислот, окисляются кислородом воздуха. В результате неферментативного окисления кислород присоединяется к ненасыщенным жирным кислотам по месту двойных связей с образованием циклической перекиси. При биохимическом окислении этот процесс катализируется ферментом липоксигеназой с образованием гидроперекиси. Так же при окислительном прогоркании идут цепные радикальные процессы, в которых участвует кислород и ненасыщенные жирные кислоты, образуя перекиси и гидроперекиси. Пероксиды и гидропероксиды являются первичными продуктами окисления. В результате дальнейших сложных превращений этих соединений образуются вторичные продукты окисления: спирты, альдегиды, кетоны, эпоксисоединения, кислоты с углеродной цепочкой меньшей длины, эфиры, оксикислоты, кетоэфиры и т.д.

Именно вторичные продукты окисления, особенно карбонилсодержащие вещества, вызывают появление неприятного вкуса и запаха жира, изменение его цвета (прогоркание). Образующиеся продукты могут менять физические свойства жира, приводить к вспениванию фритюрных масел, способствовать распаду витаминов, оказывать токсическое воздействие на организм человека.

На окисление жиров влияют: природа жирных кислот, входящих в состав жира. Чем выше непредельность остатков жирных кислот, тем больше скорость его окисления. Кислоты по способности к окислению неферментативным путем можно расположить в следующий ряд:

_{3 2 1 0}

С > C > C > C

^{18 18 18 18}

9. Определение активности липоксигеназы

Фермент липоксигеназа катализирует реакцию:

Ненасыщенная жирная кислота + О₂  гидропероксид ненасышенной жирной

кислоты

Полагают, что действию фермента подвергаются лишь те полинасыщенные жирные кислоты, которые содержат цис-цис-1,4-пентадиеновую группу, как показано ниже:

При промежуточном образовании радикалов возникает пероксид; одна двойная связь перемещается в соседнее (коньюгированное) положение, и ненасыщенная жирная кислота переходит в цис-транс-изомер:

Линолевая, линоленовая и арахидоновая кислоты окисляются ферментом с одинаковой скоростью. Жирные кислоты с транс-конфигурацией двойных связей ферментом не окисляются.

Липоксигеназа широко распространена в растительном мире. Она найдена в пшенице, семенах масличных культур, бобовых, люцерне; особенно велико ее содержание в соевой муке. В результате действия этого фермента происходит прогоркание пищевых продуктов.

Конкурентными ингибиторами фермента являются транс-линолевая и 10, 12-октадекандиеновая кислоты, также (хотя и менее эффективными) ненасыщенные и мононенасыщенные жирные кислоты.

При переработке пищевых продуктов особенно важны ингибиторы липоксигеназы, которые взаимодействуют со свободными радикалами, образующимися в качестве промежуточных продуктов, при действии этого фермента на ненасыщенные жирные кислоты, обрывают цепь превращений благодаря этому прекращают процесс окисления. Таким ингибитором является широко используемый в качестве антиоксиданта токоферол – витамин Е. Фермент можно инактивировать также термической обработкой продукта.

Препараты липоксигеназы находят ограниченное применение при выпечке белого хлеба. Во время замеса теста фермент выполняет различные функции, в результате чего улучшается цвет мякиша и увеличивается объем хлеба.

Активность липоксигеназы определяют с помощью полярографического или монометрического метода по измерению поглощения кислорода.

Принцип метода основан на измерении поглощения кислорода реакционной смесью. Максимум действия липоксигеназы злаков находится при рН 7, а липоксигеназы сои – при рН 9.

Техника определения: отвешивают 2-3 г материала и растирают с фосфатным буфером (рН 6,8) в соотношении 1:5 или 1:10. Затем в основную часть сосуда Варбурга (рис. 6) приливают 2 см³ опытной пробы (гомогената), а в боковую его часть наливают 1 см³ суспензии натриевой соли линолевой кислоты, которую готовят перед употреблением. Для этого энергично встряхивают 0,20 см³ линоленовой кислоты с 5,8 см³ 0,1 н. раствора КОН, 20 см³ фосфатного буфера с рН 6,3 и 34 см³ Н₂О.

В 1 см³ такового субстрата содержится 3,3 мг линоленовой кислоты рН 7. Далее в центральную часть прибора приливают 0,3 см³ 20 %-го раствора КОН для улавливания углекислоты. Объем жидкости в основном сосудике доводят водой до 5 см³. После этого сосуды соединяют с манометром и выдерживают на водяной бане аппарата 20 мин, до выравнивания температуры. Закрыв, верхние краны манометров и наклонив их, переливают в основную часть сосуда и затем включают качание на определенный срок. Одновременно устанавливают контрольные приборчики с манометрами, причем вместо субстрата в боковую часть сосуда наливают 1 см³ воды; в остальном поступают, так же, как и с опытным.

Показания манометров снимают через определенное число минут (5-10). Активность фермента выражают в кубических сантиметрах поглощенного кислорода на 100 мг белка или на 1 г сухой массы за условный промежуток времени.

Для вычисления объема газа, выделившегося при реакции, надо знать константу К каждого сосуда. Точную вместимость сосудов узнают по массе объема ртути (или воды), пошедшей на заполнение сосудов, и по объему манометра до нулевой точки. Зная объем 1 г ртути при определенной температуре, вычисляют исходящую вместимость сосуда. Константу К сосудов вычисляют по формуле:

,

где V₁ – общая исходная вместимость реакционного сосуда и капиллярной трубки до нулевой точки, см³;

V₂ – объем взятой жидкости в сосудик, см³;

Т – температура термостатной бани (если температура отрегулирована на 25 ⁰С, то Т= 273 + 25 = 298;

а – растворимость газов (см³) в 1 см³ воды (растворимость кислорода) при 25⁰С равна 0,028, углекислоты – 0,759;

Р₀ – давление, равное 10000 мм столба жидкости Броди.

Материалы, реактивы и оборудование: линолевая кислота (удобно получить из подсолнечного масла) или масло; 20 %-й раствор КОН; фосфатный буфер с рН 6,8; аппарат Варбурга.

Описание аппарата Варбурга

Важной частью аппарата (рис. 6) является градуированная У-образная капиллярная манометрическая трубка, один конец которой открыт, а другой сообщается с воздухом посредством крана и имеет отросток, изогнутый под углом. Трубку заполняют подкрашенной жидкостью Броди (d=1,033 г(см³)^-1, которую готовят растворением 4,6 г хлористого натрия и 1 г холеиновокислого натрия в 100 см³ воды с добавлением нескольких капель спиртового раствора (20 %-го) тимола. Для окраски жидкости добавляют немного кислого фуксина или флуоресцина. Давление в 1 атм. соответствует столбу жидкости Броди в 10 мм. Оба колена манометра 1 соединяются внизу в одну трубку, на которую надета каучуковая трубка 2, закрытая пробкой и имеющая приспособление для регулировки уровня жидкости Броди в обоих коленах (винтовой зажим 3). Боковой отросток правого колена манометра служит для соединения с реакционным сосудом 4, который имеет боковое ответвление 6 и впаянный в дно центральный стаканчик 5. Сосуды погружают в ванну большой вместимости, а манометры закрепляют снаружи. В ванне на протяжении всего опыта поддерживается строго определенная температура. В аппарате Варбурга постоянная температура обеспечивается ультротермостатом. Установка рабочей температуры производится при помощи контактного термометра с регулировкой по контрольному термометру.

Рисунок 6 – Манометрическая трубка аппарата Варбурга с сосудиком

(слева – вид спереди; справа – вид сбоку)