Метод Кьельдаля
Навеска для анализа должна содержать 20 – 40 мг азота. Сыпучий материал (зерно, солод) предварительно измельчают так, чтобы помол проходил через сито с ячейками размером 0,8 мм.
Аппаратура и реактивы. Колбы Кьельдаля вместимостью 100 – 250 см3; установка для отгонки аммиака; конические колбы вместимостью 100 – 250 см3; стеклянные пробирки диаметром до 1 см; 0,1 моль/дм3 раствор серной кислоты; 0,1 моль/дм3 раствор гидроксида натрия; раствор гидроксида натрия с массовой долей 33 %; серная кислота х. ч., d = = 1,84 г/см3; катализатор; смешанный индикатор; раствор борной кислоты с массовой долей 2 %.
Проведение анализа. При анализе муки навеску около 1 г отбирают в сухую пробирку и подвешивают ее при помощи проволочного кольца к крючку над чашкой аналитических весов. Пробирку с мукой взвешивают с точностью до ±0,0002 г. Затем муку пересыпают в колбу Кьельдаля, для чего колбе придают горизонтальное положение, вводят в ее горло по возможности глубже пробирку и, придерживая пробирку, ставят колбу вертикально, следя, чтобы частицы муки не попали на стенки горла. Пустую пробирку взвешивают и по разности двух взвешиваний находят величину навески. Анализ ведут в двух параллельных пробах и одновременно берут две навески для определения влажности.
При анализе жидких продуктов пробу отбирают пипеткой в таком объеме, который содержал бы 20 – 40 мг азота. Пипетку с пробой опускают до дна колбы Кьельдаля и переводят в колбу пробу жидкости. Жидкость подкисляют несколькими каплями концентрированной серной кислоты и выпаривают сначала на малом огне газовой горелки, а затем в водяной бане до сиропообразного состояния. При выпаривании нельзя допускать подгорания и обугливания жидкости на стенках колбы.
Для сжигания отмеривают цилиндром 10 см3 концентрированной серной кислоты, небольшим ее объемом полностью смачивают массу навески (или выпаренную пробу), затем оставшейся кислотой смывают стенки колбы, добавляют 0,5 – 1 г катализатора, колбу закрывают специальной насадкой или стеклянной воронкой диаметром 3 – 4 см и наклонно устанавливают в вытяжном шкафу на сетке над горелкой (рис. 4). Выделяющиеся при сгорании газы сильно вспенивают массу и в начале сжигания нагрев регулируют так, чтобы масса не поднималась в горло колбы и не произошел ее выброс. Когда вспенивание прекратится и масса разжижится, нагрев усиливают и при слабом кипении заканчивают озоление до полного осветления раствора. При озолении нужно следить за тем, чтобы сильно не нагревалось горло колбы, на котором должны конденсироваться пары серной кислоты.
Рис. 4. Сжигание пробы в колбе Кьельдаля
В процессе озоления колбу периодически встряхивают и переворачивают так, чтобы кислота и стекающий конденсат паров кислоты последовательно омывали всю внутреннюю поверхность колбы, не оставляя на ней обуглившихся частиц. После того как раствор приобретет синевато-зеленый без бурого оттенка цвет, кипячение продолжают еще 10 – 15 мин. Затем нагревание прекращают и колбе дают остыть.
При сжигании дверцы вытяжного шкафа должны быть закрыты, должно быть обеспечено полное удаление ядовитых газов. В охлажденную колбу по стенке небольшими порциями при перемешивании приливают 30 см3 дистиллированной воды и приступают к отгонке аммиака на стандартной установке, показанной на рис. 5. В качестве парообразователя можно брать колбу на 2 дм3. В пробку этой колбы вставляют предохранитель в виде стеклянной трубки длиной около 1 м и диаметром 5 – 6 мм. Конец трубки не доходит до дна колбы на 3 – 5 см. Для регулирования кипения между парообразователем и воронкой для щелочи вставляют тройник (на рисунке не показан), на свободный конец которого надевают резиновую трубку с винтовым зажимом.
Конец трубки опускают в стакан, где собирается конденсат. Отгонка аммиака с помощью пара из той же колбы, в которой производилось сжигание анализируемой пробы, исключает возможность потерь аммиака.
В парообразователь 1 через воронку 2 наливают немного более половины объема дистиллированной воды, для предохранения от толчков при кипении бросают туда стеклянные капилляры, открывают кран 3 и зажим 4 и воду нагревают до кипения. Запасную пустую колбу Кьельдаля 10 надевают на резиновую пробку, в которую вставлены каплеуловитель 7 и воронка 5 для щелочи. Холодильник подключают к водопроводу, под холодильник подставляют пустую коническую колбу. После закипания воды в парообразователе закрывают кран 3, включают холодильник 8, подставляя под него колбу 9, и в течение 5 – 10 мин пропаривают установку, очищая ее и удаляя следы аммиака.
Рис. 5. Аппарат для отгонки аммиака с водяным паром: 1 – парообразователь; 2 и 5 – воронки; 3 и 6 – краны; 4 – зажим; 7 – каплеуловитель; 8 – холодильник; 9– приемная колба; 10 – отгонная колба
Затем открывают краны 3 и 6, а зажим 4 закрывают; отставляют коническую колбу из-под холодильника. В другую коническую колбу на 150 – 250 см3 из бюретки отмеривают 25 см3 0,1 моль/дм3 раствора серной кислоты (или 25 см3 раствора борной кислоты), добавляют 3 – 4 капли индикатора и подставляют ее под холодильник так, чтобы конец его трубки был погружен в раствор кислоты. Вместо запасной колбы Кьельдаля на пробку надевают колбу Кьельдаля, в которой производили сжигание. Кран 6 закрывают и в воронку наливают 35 – 40 см3 раствора щелочи с массовой долей 33 %, после чего небольшими порциями спускают ее в колбу, осторожно перемешивая содержимое колбы покачиванием. Затем кран 6 закрывают, открывают зажим 4, закрывают краны 3 и 6 и пропускают пар через жидкость в колбе Кьельдаля. Кипение не должно быть бурным, чтобы капли щелочи не попадали в каплеуловитель.
Через 15 – 20 мин от начала отгонки аммиака приемную колбу опускают так, чтобы конец холодильника был выше уровня жидкости в колбе, и перегонку продолжают еще 5 – 10 мин. Скорость перегонки регулируют с помощью нагрева или краном 3 так, чтобы к концу перегонки объем жидкости в приемной колбе увеличился вдвое. По окончании перегонки открывают краны 3 и 6, а зажим 4 закрывают. Конец холодильника из промывалки обмывают водой, не вынимая из колбы, и оттитровывают избыток H2SO4 0,1 моль/дм3 раствором NaOH до появления зеленого цвета. Содержание азота Х рассчитывают (в % на сухое вещество муки) по уравнению
Х =0,14 · (а – б) · 6,25·100 /·Н (100 – W),
где а – объем взятого в приемник 0,1 моль/дм3 раствора H2SO4, см3; б – количество 0,1 моль/дм3 раствора NaOH, пошедшее на титрование избытка кислоты, см3; Н – масса навески муки, г; W – влажность муки, %.
Для пересчета на белок количество азота умножают на 6,25. Результаты анализа выражают с точностью до 0,01 %, а расхождение между двумя параллельными опытами не должно превышать ±0,3 %.
Пример. Для анализа взято 0,7256 г муки влажностью 14,6 %. В приемную колбу отмерено 25 см3 раствора H2SO4, а на обратное титрование пошло 15 см3 0,1 моль/дм3 раствора щелочи. Содержание белка Х в муке равно
0,14(25 –15) . 6,25 . 100 : [0,7256(100 – 14,6)]= 12,69 %.