Источники высокого напряжения

Источники напряжения обеспечивают подачу постоянного напряжения в диапазоне от –25 до +25 кВ. Максимально допустимый ток в капилляре не должен превышать 200 мкА. В отношении величины тока в капилляре при анализе следует ориентироваться на следующие данные: <50 мкА  отлично; 50–75 мкА  хорошо; 75–100 мкА  нормально; 100–125 мкА  допустимо; >125 мкА  плохо.

Обычно переключение полярности происходит в ручном режиме со сменой высоковольтных блоков. Также существуют приборы с автоматическим переключением полярности, что в ряде анализов позволяет добиться эффекта концентрирования пробы на этапе ее ввода (внутри капилляра)  так называемое on-line концентрирование.

Безопасность работы достигается автоматическим отключением высокого напряжения при открывании крышки прибора или при достижении максимально допустимого тока нагрузки.

Запись кривых тока и напряжения и визуальный контроль их значений на мониторе компьютера могут указать на случайные нарушения во время анализа и полезны при поиске ошибки.

Ввод пробы

Типичный объем вводимой пробы в КЭ составляет 1–20 нл. Общепринято заполнять пробой не более 2 % объема капилляра, чтобы изначально не создавать широкую зону компонентов и обеспечить достаточное время нахождения зоны пробы в капилляре для установления значимых различий в электрофоретических подвижностях.

Непосредственно перед вводом пробы капилляр промывают рабочим буферным раствором, удаляя остатки пробы от предыдущего ввода.

Различают гидродинамический, электрокинетический и гидростатический способы ввода пробы. Первые два способа реализованы во всех системах капиллярного электрофореза; гидростатический способ не нашел широкого применения.

Ввод пробы давлением (гидродинамический, пневматический) обеспечивается созданием разницы давлений между сосудом для пробы и выходным концом капилляра, при этом давление обычно повышается в сосуде для пробы, в том числе в приборах «Капель». Объем вводимой пробы зависит только от разницы давлений и времени ввода пробы; при временах ввода порядка нескольких секунд разность давлений лежит в области нескольких миллибар (1000 мбар  1 атм). При дозировании все системы КЭ оперируют величиной произведения давления на время ввода. Гидродинамический способ ввода не нарушает состав пробы и позволяет вводить ее из одной пробирки несколько раз.

Последовательность операций при гидродинамическом вводе: сначала на выходе погружают конец капилляра в рабочий буферный раствор, затем на входе  в пробу. Автоматически или в ручном режиме вводят пробу, после чего на входе заменяют пробу на рабочий буфер и переходят к анализу.

Электрокинетический ввод пробы осуществляется путем подачи высокого напряжения на электроды, когда на входе установлена пробирка с раствором пробы, а на выходе  с рабочим буфером. За счет возникающего ЭОП компоненты пробы перемещаются в капилляр. Количество введенной пробы при этом способе зависит от напряжения, времени, в течение которого приложено напряжение, и подвижности компонентов пробы. Особенностью этого ввода пробы является то, что компоненты с большей подвижностью концентрируются в капилляре по сравнению с малоподвижными ионами, которые в случае малого времени ввода, вообще могут не попасть в капилляр. По сравнению с гидродинамическим способом ввода наблюдается дифференциация состава пробы в капилляре и в исходном растворе. Электрокинетический способ ввода пробы подразумевает только однократный ввод образца из одной пробирки и наименее воспроизводим.

Гидростатический ввод пробы использует разницу в высоте между буферным сосудом и сосудом для проб. Гидростатическое давление создает поток жидкости в капилляре («сифонный» эффект) и вводит пробу в капилляр. Вводимое количество пробы зависит от разницы в высоте (обычно 5–10 см), времени (5–45 с), вязкости и плотности растворов электролита и пробы. Отметим, что гидростатическое давление служит причиной невоспроизводимости времен миграции, если во время анализа уровни буферного раствора во входной и выходной пробирках отличаются. Поэтому необходимо обращать внимание на правильное заполнение пробирок раствором ведущего электролита перед анализом (равными порциями, например по 500 мкл), своевременное их перезаполнение (через 5‑7 анализов), а также следует тщательно выверять установку прибора на горизонтальной плоскости.