optika-1

растворителя. Поэтому анализ этих явлений дает информацию об исследуемом веществе. Соответственно методы исследования делятся на следующие:

-методы абсорбционной спектроскопии;

-нефелометрия - анализ светорассеяния;

-люминесцентный (флуориметрический) метод анализа.

Все три метода широко используются в биомедицинских исследованиях и лабораторной диагностике, однако наиболее часто применяются методы абсорбционной спектроскопии. Последние можно условно разделить на "спектрофотометрию" и "фотоколориметрию" (анализ поглощения соответственно монохроматического и полихроматического света веществом). Заметим, что в строгом понимании излучение называется монохроматическим, если оно имеет одно значение частоты. Реально любое излучение представляет собой совокупность фотонов с различными частотами. В этом основная условность деления методов абсорбционной спектроскопии. В то же время оба метода основаны на общем принципе - существовании пропорциональной зависимости между светопоглощением и концентрацией поглощающего вещества. Кроме того, оба метода могут использоваться для анализа поглощения света как в видимом диапазоне длин волн (окрашенные вещества), так и в невидимом - ультрафиолетовом (УФ) и инфракрасном (ИК).

С аппаратурной точки зрения фотоколориметрический метод использует более простую, но при этом и менее точную технику (погрешность порядка 1- 3%) - фотоколориметры. Спектрофотометрия использует более сложные и совершенные приборы - спектрофотометры, позволяющие проводить анализ как окрашенных, так и бесцветных соединений по избирательному поглощению монохроматического света в видимом, УФ- и ИКобластях спектра. Спектрофотометрический метод анализа характеризуется большей точностью (погрешность порядка 1-0.5%). Кроме повышенной точности, этот метод обладает и другими дополнительными возможностями.

Цель настоящей работы:

1)в области теории:

-знакомство с элементарной теорией поглощения света веществом;

-знакомство с оптическими параметрами, характеризующими поглощательную способность вещества;

-знакомство с устройством и принципом действия фотоэлектроколориметра;

2)в области эксперимента:

-практическая работа с фотоэлектроколориметром;

-определение спектральной характеристики вещества с помощью фото-электроколориметра;

-определение концентрации вещества в растворе с помощью фотоколориметра.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

61

1. Поглощение света веществом

Пpи взаимодействии световых фотонов с веществом атом (молекула) может поглотить квант энеpгии hν и соответственно перейти из основного состояния с энергией E1 в возбужденное с энергией E2. Поглощение кванта происходит только в том случае, если энергия поглощаемого кванта совпадает с разностью энергий E между квантовыми энергетическими состояниями E1 и E2

:

на элементарный (очень узкий) слой вещества толщиной dL, а dI - изменение этой интенсивности на поглощающем свет слое dL (рис.1). Связь между этими величинами устанавливается законом Бугера-Ламберта:

Однородные слои одного и того же вещества одинаковой толщины поглощают одну и ту же долю падающей на них световой энергии (при постоянной концентрации растворенного вещества).

Математически эта формулировка закона может быть записана в виде:

где α - коэффициент поглощения света веществом; минус означает тот факт, что свет, пpоходя чеpез слой вещества dL, ослабляется. Физический смысл этого закона состоит в том, что коэффициент поглощения α не зависит от интенсивности света, распространяющегося в веществе, и от толщины поглощающего слоя. Этот коэффициент зависит от природы вещества, его концентрации в растворе и спектральных свойств светового потока. С целью получения интенсивности света Il на выходе из вещества толщиной L проинтегрируем левую и правую части соотношения (2) в пределах от 0 до L:

или

62

где I0 - интенсивность света на входе в вещество. Из формулы (4) видно, что интенсивность света прошедшего через вещество уменьшается в соответствии с показательным (экспоненциальным) характером функциональной зависимости от толщины слоя L. В литературе соотношение (4) часто называют форму-

лой (или законом) Бугера.

Кроме величины α, введем еще два параметра, которые характеризуют поглощательную способность вещества: коэффициент пропускания и оптическую плотность.

Отношение интенсивности света, прошедшего через вещество, к интенсивности падающего на него излучения называется коэффициентом пропускания:

Из (7) видно, что оптическая плотность D пропорциональна α.

Бугер, а затем на основании экспериментов Бер высказали мысль о том, что поглощение света веществом зависит прямо пропорционально от концентрации вещества в растворе C:

Если концентрация вещества C выражена в молях на литр, а толщина слоя вещества L - в сантиметрах, то α0 - молярный коэффициент поглощения света веществом, не зависящий от концентрации вещества C, но зависящий от природы вещества и спектра света. Формула (8) получила название закон Бера. Его физический смысл состоит в том, что поглощательная способность молекулы вещества не зависит от окружающих молекул. В действительности этот закон следует рассматривать как правило, а не закон, т.к. существуют многочисленные отступления от

(8). Например, сильное влияние на поглощательную способность вещества оказывает растворитель, а также величина концентрации самого вещества. Реально формула (8) справедлива лишь для малых концентраций веществ. Подставим (8) в (4), тогда получим объединенный закон Бугера-Ламберта-Бера:

63

откуда видно, что оптическая плотность D пря-

мо пропорциональна концентрации вещества C. Графически эта зависимость представляется прямой линией (рис.2), проходящей через начало координат, если растворитель прозрачный. Эта линия называется градуировочной, она широко используется на практике для определения концентрации вещества C : оптически измеряется величина D для раствора вещества с неизвестной концентрацией, а затем по графику

определяется концентрация вещества. Так как Рис.2. при этом концентрация вещества определяется

для окрашенных (светопоглощающих) растворов, то этот метод получил название концентрационная колориметрия (colour - цвет, окраска).

Если в растворе содержится n светопоглощающих компонентов, которые не вступают друг с другом в химическое взаимодействие, то оптическая плотность такого раствора будет равна сумме парциальных оптических плотностей всех содержащихся в растворе светопоглощающих компонентов:

где α1 , α2 , ... , αn - молярные коэффициенты светопоглощения компонентов смеси; С1 , С2 , ... , Сn - молярные концентрации компонентов смеси. Принцип аддитивности (11) давно известен и подтвержден экспериментально. На использовании этого принципа основаны все количественные методы спектрофотометрического анализа многокомпонентных светопоглощающих систем.

Как отмечалось выше, при поглощении светового кванта атом (его электрон) переходит из основного состояния в возбужденное. Аналогичный процесс происходит в молекуле. Молекула поглощает часть энергии падающего излучения, и поглощенная энергия расходуется на переход электронов из одного состояния в другое возбужденное. Так как различные электроны в молекуле обладают неодинаковыми энергиями в основном состоянии, то они могут быть возбуждены излучением разных длин волн. Поэтому все светопоглощающие соединения характеризуются избирательным поглощением света. Зависимость коэффициента поглощения α (или D, или Т) от длины волны светового потока характеризует электронный спектр поглощения рассматриваемой молекулы. В отличие от атомных спектров, представляющих собой отдельные линии, спектр поглощения молекулы состоит из полос, отличающихся друг от друга величинами, например, максимума оптической плотности Dmax и длины волны, соот-

ветствующей этому максимуму

λmax (рис.3).

Из рис.3 видно, что спектр поглощения света молекулой не бес-

Рис.3.

конечно узкий (линия в спектре), а имеет конечную ширину Δλ = λ2 - λ1 (полоса поглощения в спектре), причем λ1 и λ2 соответствуют половинному уровню Dmax. Часто отдельные компоненты спектра накладываются друг на друга, и тогда ширина полосы поглощения увеличивается, в пределе спектр сложных молекул может быть сплошным. Изучение спектров многокомпонентных систем позволяет выявить состав смеси и определить концентрацию каждой из компонент.

При определении концентрации вещества в растворе важным параметром метода является его чувствительность S:

Чувствительность показывает, насколько сильно изменяется оптическая плотность вещества при изменении его концентрации. Естественно, что увеличение S желательно, так как это дает возможность измерять малые концентрации веществ

откуда видно, что при больших S даже малым изменениям концентрации dC могут соответствовать значительные величины dD, что нетрудно зарегистрировать аппаратурно. Отметим, что геометрически чувствительность - это тангенс угла наклона градуировочного графика (рис.2). Подставим (10) в (12), тогда получим:

Из (14) видно, что для увеличения чувствительности S необходимо выбирать такую длину волны зондирующего вещество светового потока, на которой коэффициент поглощения α был бы максимальным.

2. Устройство и принцип действия фотоэлектроколориметра

Промышленность выпускает несколько типов фотоэлектроколориметров, в данной работе рассмотрим один из приборов - КФО (колориметр фотоэлектрический однолучевой, рис.4). Свет от источника 1 (лампа накаливания) проходит через один из шести светофильтров 2, систему линз (конденсор) 3, кювету с раствором исследуемого вещества 4, фотометрический клин 5 и

Рис.4.

фокусируется линзой 6 на фотоприемник 7 (полупроводниковый фотодиод). Индикатор 8 служит для регистрации фотоэлектрического сигнала. Выбор светофильтра, а следовательно, длины волны оптического видимого излучения осуществляется вращением диска, в который вмонтированы светофильтры. Фотометрический клин представляет собой две светопоглощающие призмы, при взаимном перемещении которых изменяется оптическая длина пути светового потока и, следовательно, оптическая плотность клина (формула (7)). Таким образом, оптический клин позволяет изменяет интенсивность светового потока.

Принцип действия прибора основан на сравнении уровней фотоэлектрических сигналов, возникающих при пропускании света поочередно через стандартную кювету с раствором исследуемого вещества, а затем через аналогичную кювету с растворителем. Пpибоp непосpедственно измеpяет коэффициент пpопускания исследуемого pаствоpа как отношение показаний индикатоpа:

где il, i0 - показания индикатоpного пpибоpа для pаствоpа исследуемого вещества и pаствоpителя соответственно. Оптическая плотность вещества определяется по формуле (6) или с использованием Таблицы 1 Приложения.

Конструктивно прибор КФО выполнен следующим образом (рис.5). Поверх основного корпуса располагается стрелочный индикатор 1 со шкалой на 100 деле-

ливаемой длиной волны света определяется Таблицей 2 Приложения. Для включения прибора в сеть на его задней стенке имеется тумблер.

66

-кювету с неизвестной концентрацией раствора вещества;

-кювету с растворителем.

После включения прибора вставьте кювету с растворителем в держатель кювет в оптическом блоке прибора.

В Н И М А Н И Е !

*Кювету следует держать за боковые грани, через которые зондирующий световой луч не проходит.

Аналогично установите в держатель кювету с раствором вещества средней концентрации из имеющихся. По пунктам 6-11 произведите измерение оптической плотности раствора для 1-5 фильтров. Запишите результаты измерений в таблицу 1. Для определения длины волны, соответствующей светофильтру, следует воспользоваться Таблицей 2 Приложения.

По результатам эксперимента постройте спектральную характеристику исследуемого вещества. При этом по горизонтальной оси расположите значение длины волны, а по вертикальной - оптическую плотность D.

На основании спектральной характеристики и таблицы определите длину световой волны и соответствующий фильтр, при которых D максимальна. Установите этот светофильтр и дальнейшие измерения выполняйте при этом светофильтре.

Аналогично измерьте оптическую плотность растворов с известными концентрациями в порядке их возрастания, результаты занесите в таблицу 2:

Таблица 2

C , %

I0

I

T, %

D

По результатам эксперимента постройте градуировочную кривую. При этом по горизонтальной оси отложите концентрацию вещества, а по вертикальной - оптическую плотность. Обратите внимание на линейность зависимости D(C). Если эта линейность нарушается, то произведите графическое усреднение результатов.

68

Измерьте оптическую плотность исследуемого раствора (по пунктам 6-11). По градуировочному графику определите концентрацию исследуемого раствора.

По окончании эксперимента выключите прибор и сдайте рабочее место и принадлежности лаборанту.

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ

1.Физические явления, наблюдаемые при взаимодействии света с вещест-

вом.

2.Механизм поглощения света веществом. Зависимость явления поглощения света от его длины волны.

3.Относительное уменьшение интенсивности света слоем вещества. Закон Бугера. Монохроматический натуральный показатель поглощения вещества.

4.Зависимость показателя поглощения от концентрации раствора. Закон Бера. Закон Бугера-Ламберта-Бера.

5.Коэффициент пропускания и оптическая плотность растворов. Соотношение, связывающее эти величины.

6.График зависимости интенсивности прошедшего света от концентрации

итолщины слоя раствора.

7.График зависимости относительного изменения интенсивности прошедшего света от толщины слоя вещества.

8.График зависимости коэффициента пропускания и оптической плотности от концентрации и толщины слоя раствора.

9.Принцип работы фотоэлектроколориметра. Непосредственно измеряемая прибором величина, ее связь с концентрацией раствора.

10.Условия измерения концентрации растворов:

а) выбор длины волны света; б) исключение зависимости оптической плотности от толщины слоя

раствора.

11. Границы применимости методов концентрационной фотоколориметрии (величины концентраций, виды растворов).

ЛИТЕРАТУРА

1.Методическое руководство к лабораторным занятиям "Оптические методы и аппаратура для биомедицинских исследований", лабораторная работа 5.

2.Ливенцев Н.М. Курс физики для медицинских институтов. М.: Высш. шк., 1978. Т.1. С.238-241.

3.Ремизов А.Н. Курс физики, электроники и кибернетики. М.: Высш. шк., 1982. С.351-354.

4.Ремизов А.Н. Медицинская и биологическая физика. М.: Высш. шк., 1987. С.516-518.

5.Эссаулова И.А., Блохина М.Е., Гонцов Л.Д, Руководство к лабораторным работам по медицинской и биологической физике / Под ред. Ремизова А.Н. М.: Высш. шк., 1987. С.236-242.

69

6. Биофизические методы исследования / Под ред. Ф. Юбера. М.: Изд-во иностр. лит., 1956. С.245-250.

7. Булатов М.И., Калинкин И.П. Практическое руководство по фотометрическим методам анализа. Л.: Химия, 1986. С.31-46, 53-54.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Таблица 1

1 нм = 10-9 м

70