optika-1

САРАТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И АППАРАТУРА

ДЛЯ БИОМЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ РУКОВОДСТВО К ЛАБОРАТОРНЫМ РАБОТАМ

Под редакцией В. А. Дубровского

Рекомендовано учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России

в качестве учебно-методического руководства для студентов медицинских вузов

ИЗДАТЕЛЬСТВО САРАТОВСКОГО МЕДИЦИНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

2009

УДК 585 (07)

В учебно-методическом руководстве представлены шесть лабораторных работ по оптике, каждая из которых содержит необходимый теоретический материал, описание экспериментальной части работы, вопросы к самоподготовке студентов, а также список необходимой литературы. Особенностью настоящего руководства является то обстоятельство, что представленные в нем лабораторные работы в основном базируются на серийных оптических приборах, многие из которых используются в биомедицинских исследованиях. Описание каждой из лабораторных работ содержит сведения о биомедицинском применении соответствующего оптического метода или прибора. Кроме того, авторы предприняли попытку наряду с конкретным изложением того или иного оптического явления (прибора) дать студентам и некоторые общие представления о соответствующих оптических методах и определенных классах приборов.

Руководство подготовлено кафедрой медицинской и биологической физики Саратовского государственного медицинского университета и предназначено для студентов медицинских вузов.

Составители: канд. физ.- мат. наук В. А. Дубровский., В. В. Березин, Н. Б. Зотов, С. В. Трубецкова.

Авторы выражают признательность ассистенту И. В. Щербаковой за помощь в оформлении и подготовке настоящего руководства к опубликованию.

Рецензенты: докт. мед. наук Г. П. Гладилин; канд. физ.- мат. наук Ю. П. Синичкин.

Одобрено и рекомендовано к изданию Центральным координационнометодическим советом СГМУ.

ISBN № 5-7213-0049-3

©: Саратовский медицинский университет, 2009.

2

РАБОТА 1

ИЗУЧЕНИЕ УСТРОЙСТВА И ХАРАКТЕРИСТИК ОПТИЧЕСКОГО МИКРОСКОПА

Оптический микроскоп - это прибор для получения увеличенных изображений малых объектов. Человеческий глаз при нормальной остроте зрения на расстоянии наилучшего видения может различить мелкую структуру объекта, если соседние элементы структуры находятся на расстоянии порядка 0.05 мм или больше. Размеры форменных элементов крови, бактерий, других клеток значительно меньше этой величины, что приводит к необходимости использования увеличительных систем и, в частности, микроскопа при проведении исследований микрообъектов. Микроскоп дает возможность изучать структуру объекта при расстоянии между ее элементами до 0.00025 мм. Заметим, что расстояние наилучшего видения - это такое расстояние между глазом и предметом исследования, при котором мышцы, меняющие кривизну хрусталика, испытывают наименьшее напряжение (для нормального глаза около 250 мм).

Цель настоящей лабораторной работы: 1) в области теории:

- ознакомиться с основными типами приборов современной микроскопии; - изучить принцип работы оптического микроскопа; - ознакомиться с характеристиками оптического микроскопа;

- ознакомиться с некоторыми способами измерений микрообъектов; 2) в области эксперимента:

-расчитать и измерить ряд характеристик оптического микроскопа;

-определить некоторые характеристики устройств, комплектующих оптический микроскоп с целью проведения микроскопических измерений;

-измерить размеры предложенного биологического препарата.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

1. Основные типы приборов современной микроскопии

Увеличенное изображение объекта может быть получено с помощью электромагнитных волн оптического диапазона (оптические микроскопы), ультрафиолетовых волн (ультрафиолетовые микроскопы), потоков высокоскоростных электронов в вакууме (электронные микроскопы). Наибольшее распространение получили оптические микроскопы.

Среди оптических микроскопов можно выделить ряд модификаций:

1) биологический микроскоп - наиболее распространенный микроскоп для цитологических, микробиологических, гистологических, гематологических и других исследований. Применяется для исследования объектов в проходящем и отраженном свете (как поляризованном, так и неполяризованном).

3

2)измерительный микроскоп - прибор, приспособленный для измерения размеров микроскопических объектов. Существуют микроскопы, у которых измерения производятся только в одном направлении, у других в двух или трех направлениях соответственно трем осям прямоугольной системы координат.

3)поляризационный микроскоп служит для изучения анизотропных объектов. Заметим, что вещество называется анизотропным, если его свойства, характеристики (механические, оптические, электрические и др.) различны в различных направлениях пространства. В случае оптической анизотропии оптические характеристики вещества (например, скорость распространения света,

аследовательно, абсолютный показатель преломления среды) зависят от направления распространения света в веществе. Биологические ткани, например, мышечная, костная, нервная и др., обладают оптической анизотропией, поэтому их свойства можно исследовать с помощью поляризационного микроскопа.

4)фазово-контрастный микроскоп служит для наблюдения объектов, слабо поглощающих свет. Изображение таких объектов малоконтрастное, трудно различимое. Фазово-контрастный метод основан на том, что световые волны при прохождении через объекты с разной оптической плотностью (показателем преломления света вещества) и участки объекта различной толщины поразному изменяют фазы своих колебаний. Эти фазовые изменения, не воспринимаемые глазом, преобразуются с помощью специального оптического устройства в изменение амплитуд, что приводит к ослаблению или усилению интенсивности прошедшего через объект света и, соответственно, к повышению контрастности изображения.

5)интерференционный микроскоп позволяет наблюдать неконтрастные биологические объекты. Принцип действия такого микроскопа состоит в том, что каждый луч, входящий в микроскоп, раздваивается, причем лишь один из них проходит через исследуемый препарат. В окулярной части микроскопа лучи соединяются и интерферируют (накладываются друг на друга) между собой. В зависимости от оптической разности хода этих двух лучей изображения практически прозрачных (бесцветных) объектов получаются контрастными, относительно легко различимыми и даже цветными. На основании измерения разности хода могут быть расчитаны вес сухого вещества в микрообъекте, показатель преломления и толщина объекта. Комбинированный метод с помощью ультрафиолетового и интерференционного микроскопов позволяет определить содержание нуклеиновых кислот в общем весе биологического микрообъекта.

6)люминесцентный микроскоп предназначен для наблюдения микрообъектов, которые при некоторых условиях способны люминесцировать, то есть излучать свет. Этот метод широко применяется в микробиологии, вирусологии, в пищевой промышленности и пр.

7)микроскоп проекционный - прибор для проектирования на экран изображений микроскопических препаратов.

В настоящей лабораторной работе изучается устройство и определяются характеристики наиболее широко используемого в биомедицинских исследованиях и диагностике оптического биологического микроскопа, а также рас-

4

сматриваются комплектующие его элементы для изображения и измерения микроскопических объектов.

Рассмотрению устройства и принципа действия оптического микроскопа предпошлем краткое знакомство с оптическими линзами, прохождением лучей через линзы, с характеристиками линз.

2. Конструкции, ход лучей, характеристики оптических линз

Известно, что в однородной среде свет распространяется прямолинейно. Одно из основных понятий геометрической оптики - луч света - представляет собой линию, вдоль которой переносится световая энергия. Луч можно представить себе как бесконечно тонкий пучок света. Рассмотрим прохождение светового луча через оптическую линзу.

Линзами называют прозрачные тела, ограниченные с двух сторон сферическими (одна из сторон может быть и плоской) поверхностями и имеющие показатель преломления, отличный от показателя преломления окружающей среды. Такие линзы называются сферическими, существуют линзы и других типов. По характеру действия сферические линзы можно разделить на две груп-

пы:

1) собирающая линза - центральная часть линзы больше, чем на периферии;

2) рассеивающая линза - центральная часть уже, чем на периферии.

Так как ход лучей в микроскопе описывается с помощью системы собирающих линз, то исключим из рассмотрения рассеивающие линзы. Собирающая линза

представлена на рис.1.

Рис.1. Линия О1О2, проходящая через центры сферических поверхностей, ограничивающих линзу, называется главной оптической осью линзы. Всякая линза имеет точку, называемую оптическим центром линзы (точка О на рис.1), проходя через которую луч света не меняет своего направления. Любая линия АВ, проведенная через оптический центр линзы, называется побочной осью линзы. Побочных оптических осей линза имеет неограниченное число. Плоскость MN, проведенная через оптический центр линзы перпендикулярно ее главной оптической оси, называется плоскостью линзы. Часто при построении хода лучей через линзу изображают не линзу непосредственно, а лишь положение ее плоскости.

На рис.2 изображен ход оптических лучей через собирающую линзу, если падающие на линзу световые лучи параллельны главной оптической оси. Лучи L1M1 и L2M2, проходя через линзу и преломляясь в ней, пересекают главную оптическую ось в одной точке на главной оптической оси. Эта точка называется главным фокусом линзы (точка F). В главном фокусе собираются все лучи, падающие на линзу

5

параллельно главной оптической оси. Расстояние OF между оптическим центром линзы и ее главным фокусом называется фокусным расстоянием собирающей линзы. Фокусное расстояние линзы является главной ее характеристикой.

Если параллельные лучи света падают на линзу под некоторым углом к главной оптической оси, то они также фокусируются в точку, лежащую на плоскости, проведенной через фокус линзы перпендикулярно главной оптической оси. Эта точка называется побочным фокусом линзы, а плоскость -

фокальной плоскостью линзы. Фокальных плоскостей собирающая линза име-

диусов сферических поверхностей, ограничивающих линзу, и от показателя преломления вещества, из которого сделана линза. Отметим, что линза является собирающей, если ее показатель преломления больше, чем показатель преломления окружающей среды.

Другой характеристикой линзы является ее оптическая сила - величина, обратная фокусному расстоянию ( D=1/F ). За единицу оптической силы принимается диоптрия - оптическая сила такой линзы, фокусное расстояние которой F=1 м. Условились оптическую силу собирающей линзы (фокус которой действителен) считать положительной, а рассеивающей - отрицательной.

Рассмотрим ход лучей и принцип построения изображения для собирающей линзы (рис.3).

На рис.3 отрезок AB является предметом. Для построения изображения

ния двух его крайних точек A и B. Для этого изобразим два световых луча:

а) луч AC, параллельный главной оптической оси, направляется линзой DE в точку главного фокуса (луч CA1);

б) луч, проведенный из точки А через центр линзы О, не изменяет своего направления и попадает в точку А1.

6

Пересечение построенных двух лучей в точке А1 дает в этой точке изображение точки А предмета. Аналогично определяется изображение В1 точки предмета В. Тогда отрезок А1В1 является изображением предмета АВ.

Отношение величины изображения к величине самого предмета называется линейным увеличением линзы - это третья характеристика линзы. Из рассмотрения соответствующих треугольников на рисунке 3 можно получить формулу для линейного увеличения K (1) и формулу линзы (2):

Из (3) видно, что линейное увеличение линзы K не является величиной постоянной, оно зависит от расположения предмета по отношению к линзе.

3. Устройство оптического микроскопа

3.1. Конструкция микроскопа

Микроскоп состоит из оптической, механической и осветительной частей. Оптическая часть микроскопа оформлена в виде тубуса - металлической трубки (зрительная трубка), в которой размещается система линз для получе-

ния увеличенного изображения объекта (ход лучей см. ниже).

Механическая часть представляет собой следующее: на массивном основании укрепляется штатив, на котором имеются два винта для изменения расстояния между рассматриваемым объектом и тубусом. Один винт служит для грубой настройки микроскопа (макрометрический винт), другой - для тонкой настройки на четкое (резкое) изображение объекта (микрометрический винт). К нижней части штатива прикреплен предметный столик для размещения исследуемого объекта.

Осветительная часть микроскопа включает в себя зеркало и конденсор (систему линз, собирающую лучи от источника для освещения объекта), расположенные под предметным столиком.

3.2. Ход лучей в микроскопе

Оптическая система микроскопа состоит из двух частей - объектива (Об) и окуляра (Ок). Объектив и окуляр в простейших микроскопах представляют собой одиночные собирающие линзы, которые закреплены на концах зрительной трубки. В современных микроскопах объективы и окуляры являются слож-

7

ными оптическими системами, они состоят из совокупности линз. Это позволяет избежать ряда искажений, которые дают оптические линзы. С помощью оптической системы получается увеличенное изображение объекта. Ход лучей в микроскопе представлен на рис.4.

Рис.4

Предмет AB помещается перед объективом между фокусом и двойным фокусом. Чем ближе к фокусу объектива (FОб) расположен предмет AB, тем большим согласно (3) получается его изображение A1B1. Построение изображения А1В1 предмета АВ на рис.4 выполнено идентично рис.3. Изображение А1В1 оказывается увеличенным, действительным и перевернутым по отношению к предмету АВ. Это изображение рассматривается через окуляр (Ок), для которого оно является предметом. Важно отметить, что А1В1 располагается от окуляра на расстоянии несколько меньшем фокусного расстояния окуляра

(FОк).

Как видно из рис.4, световые лучи после преломления в окуляре расходятся в пространстве, они не дают действительного изображения. Однако, попадая в глаз наблюдателя, лучи фокусируются им на его сетчатку, формируя действительное изображение предмета. При этом глаз эквивалентен оптической линзе. Продолжая построение попадающих в глаз наблюдателя лучей (пунктирные линии), получим мнимое изображение предмета А2В2, которого в действительности не существует: если в плоскость, в которой лежит мнимое изображение А2В2, поместить экран, то изображение на экране будет отсутст-

8

вовать. Однако мы видим "изображение" А2В2, так как, во-первых, глаз автоматически "восстанавливает" ход попавших на него лучей и, во-вторых, после преломления окуляром микроскопа лучи попадают в глаз так, как если бы А2В2 являлось реальным предметом. Отметим, что, как видно из рис.4, микроскоп дает увеличенное, мнимое, перевернутое изображение предмета.

При рассмотрении предметов с помощью микроскопа глаз располагается так, что изображение получается на расстоянии наилучшего зрения от окуляра (точнее, от расположенного вблизи него глаза наблюдателя). При таком рассмотрении предмета аккомодация глаза совершается без напряжения. Как отмечалось выше, для нормального зрения это расстояние равно 25 см.

4. Характеристики микроскопа

Основными характеристиками микроскопа являются: увеличение, поле зрения, разрешающая способность прибора.

4.1. Увеличение микроскопа

Линейное увеличение микроскопа показывает, во сколько раз величина изображения предмета больше размера самого предмета, и определяется формулой (см. рис.4)

Найдем связь между линейным увеличением микроскопа и параметрами оптической системы. При выводе формулы для коэффициента увеличения будем пользоваться обозначениями, введенными на рис.3 и 4. В соответствии с формулой (1)

Для любой линзы ее увеличение определяется отношением расстояния от оптического центра линзы до изображения (b) к расстоянию от оптического центра до предмета (a) (рис.3):

Для объектива можно считать, что а ≈ FОб . Расстояние от объектива до изображения примерно равно сумме фокусного расстояния FОб и длины тубуса L, которая равна расстоянию от заднего фокуса объектива до переднего фокуса окуляра (рис.4):

Для большего увеличения используются объективы с малым фокусным расстоянием, поэтому, пренебрегая в (7) величиной FОб по сравнению с L, получаем: b≈L. Тогда из (6) с учетом (7) получаем увеличение объектива:

9

С другой стороны, как было сказано выше, мнимое изображение А2В2 находится от глаза на расстоянии наилучшего зрения G, а предмет для окуляра А1В1 находится вблизи его переднего фокуса (FОк), поэтому (см. рис.4)

Подставляя в (11) формулы (8) и (10), получаем выражение для линейного увеличения микроскопа:

Параметры L, FОб, FОк задаются конструкцией микроскопа и выбором типов объективов и окуляров: изменяя параметры FОб и FОк в соответствии с исследовательской задачей, например, размерами наблюдаемого объекта, можно варьировать величиной увеличения микроскопа. Заметим, что величины KОб и KОк указываются на оправах объектива и окуляра соответственно.

4.2. Поле зрения микроскопа

Поле зрения характеризует часть пространства (или плоскости), видимую в микроскоп. Оно измеряется диаметром этой части пространства (плоскости).

4.3. Разрешающая способность микроскопа

Микроскоп позволяет различать (разрешать) мелкие детали предмета, которые для невооруженного глаза сливаются в одну точку. Наименьшее расстояние между двумя точками объекта, которые воспринимаются при рассмотрении в микроскоп отдельно, называется наименьшим разрешаемым расстоянием микроскопа. Это расстояние определяется формулой

где λ - длина волны света, которым освещается объект. Из (13) видно, что чем короче длина волны λ, тем меньше величина X и, следовательно, более мелкие объекты могут быть рассмотрены с помощью микроскопа. Однако при выборе λ (цвета светового потока) следует учитывать то обстоятельство, что

10