bioxim-t 15

(

УДК 547,963.1

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ И НЕКОТОРЫХ СВОЙСТВ МОЛЕКУЛЫ ГАПТОГЛОБИНА ОВЕЦ И ИХ ПЛОДОВ

В настоящее время считается, что своеобразными маркерами -яри изучении генетической структуры популяции и закономерностей микроэволюционного процесса могут служить белки, наследственная структура которых известна.

Один из важнейших показателей генетической гетерогенности популяции — характер полиморфизма этих белков. К ним относится гаптоглобин (Нр). Это гемоглобинсвязывающий гликопротеид сыворотки крови, обладающий защитной функцией в организме, которая проявляется в резком изменении его концентрации при различных патологиях. Например, при болезнях, связанных с повреждениями тканей, уровень его- в крови резко возрастает. Это вызвано тем, что именно гаптоглобин в, комплексе с гемоглобином является активным стимулятором биосинтез за коллагена, так необходимого для заживления ран (У1еШагс1 е. а.,, 1974). При гемолитических же анемиях концентрация этого белка в .'крови резко падает. В этом случае гаптоглобин предохраняет организм отпотери дефицитного железа геминовой группы, связывая гемоглобин (Нв), выделяющийся в плазму, в прочный гаптоглобин-гемоглобиновый комплекс (Нр — Нв). При этом Нр не только механически связывает, гемоглобин, но и активно участвует в катаболизме Нв (Успенская, 1970)..

В настоящее время установлено, что биохимический полиморфизм: присущ гаптоглобину человека (Алимова, 1968; Кдгк, 1968) и многих видов животных (ТгаУ13 е. а., 1972; ЩсМег, 1974; Плахотников, 1976).

Ранее было установлено, что в сыворотке крови овец встречаются: три типа гаптоглобина: НрА, НрВ, НрС (Бейсембаева и др., 1974). Исследования четвертичной структуры НрА и НрС показали, что их молекулы состоят из двух типов субъединиц а и р (Бейсембаева и др., 1975, 1977). Анализ сыворотки крови плодов овец показал, что гаптоглобинсентизирующая система функционирует в организме даже у 45дневных плодов (Бейсембаева, Абилова, 1979). В период внутриутробного развития встречаются три типа гаптоглобина: Нр1, Нр2 и НрЗ,. молекулы которых также состоят из двух типов субъединиц (Бейсембаева и др., 1977). Анализ аминокислотного состава указал на существование значительных различий в количестве ряда аминокислот (Бейсембаева, Абилова, 1978).

В настоящей работе приводятся результаты дальнейшего исследования структуры и некоторых свойств гаптоглобина овец и их плодов.

Выделяли и очищали препараты НрА, НрС, Нр1 и Нр2, согласно ранее описанному методу (Бейсембаева, Джусупова, 1975). Анализ препаратов Нр методом скоростной седиментации осуществляли на аналити- , ческой ультрацентрифуге МОМ3170 (Венгрия). Пероксидазную актива ность определяли по методу Л. А. Отуеп, С. ВеНег (1960).

Электрофоретическое исследование гомогенных препаратов "НрА,. НрС, Нр1 и Нр2..в полиакриламидном геле показало, что они различается по количеству компонентов: НрА и Нр1 — 1, Нр2 — 3, НрС —- 8—10. Множественность полос на электрофоренграммах НрС и Нр2 может быть связана с присутствием молекул, отличающихся молекулярной'массой, либо общим зарядом.

При седиментадионном анализе этих типов гаптоглобина также получается разная картина (см. рисунок): молекулы НрА и Нр1 (б) седи-

ции для НрС и Нр1, в случае же НрА наблюдается небольшое уменьшение этой величины, а для Нр2 она практически не изменяется для медленно движущегося компонента. Как отмечалось ранее (Бейсембаева,. 1975), молекула НрА лобильна и диссоциация происходит в достаточно мягких условиях. Очевидно, это и уменьшает коэффициент седиментации НрА при разбавлении раствора.

При исследовании различных препаратов НрА наблюдаются небольшие отличия в значении коэффициента седиментации (4,04 5 в одноь?г случае и 3,75 — в другом). По-видимому, это связано с различной степенью активности препаратов, что оказывает влияние и на злектрофоретическую подвижность (Бейсембаева, Джусупова, 1975).

Исследования молекул НрС и НрА методом гельфильтрадии на ко--

трипсин (23 800), сывороточный альбумин (/0000), у-глобулин (160000). Свободный объем колонки определяли с помощью декстрана голубого

(2 000 000).

НрС элюируется двумя пиками; фракции, соответствующие им были активными. Молекулярная масса этих компонентов равна 150 000 и 190 000. В то же время для субъединиц НрС, по данным О. Маг1у и 5. Могейу (1976), она равна: а— 13000, р — 37 000. Анализ молекулы НрА методом электрофореза в полдакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия дал значения молекулярных весов а и § субъединиц 14 700 и 37 700 соответственно. Сопоставляя эти значения^ с величинами молекулярной массы НрА и НрС, можно видеть, что молекула НрА является тетрамером, и ее структура может быть представлена как «2р2, а НрС является смесью полимеров состава а3Рз, а ^ .

Рис. 2. Влияние концентрации сульфата аммония на пероксидазную активность Нр—Нв комплекса

? а , е &

нощейтала емттл ,мм<ш$

Таким образом, полученные результаты подтверждают предположение, что множественность полос НрС связана с 'присутствием полимеров разной молекулярной массы.

Одно из наиболее характерных свойств гаптоглобина — его способность связывать гемоглобин в прочный комплекс, который проявляет более высокую пероксидазную активность в кислой области рН (Успенская, 1970). На этом свойстве основаны методы определения гаптоглобина в сыворотке крови. Поэтому необходимо было выяснить: как влияют различные соли, используемые при исследовании структуры и свойств этого белка, выделении и очистке на его гемоглобинсвязывающую способность.

На первой стадии выделения гаптоглобина используется фракционное осаждение сульфатом аммония. На рисунке 2 представлено влияние различных концентраций этой соли на гемоглобинсвязывающую способность, которую выражали в виде пероксидазной активности. Из этих данных следует, что сульфат аммония инактивирует гаптоглобин. Однако тщательный диализ вновь возвращает активность Нр. Вероятно, такое влияние сульфата аммония связано с тем, что при высокой концентрации происходит адсорбция его молекул на поверхности молекулы белка,-которая блокирует Нв связывающее место. Диализ приводит к десорбции молекул соли, и участок, ответственный за связывание Нв, вновь становится доступным.

В таблице 2 приведены результаты исследования влияния различных солей на активность Нр — Нв комплекса.

Как видно из этих данных, наиболее сильное инактивирующее действие оказывает додецилсульфат натрия. Даже, при концентрации

УДК 575.125.172:636.32/38

ПОКАЗАТЕЛИ БЕЛКОВОГО И АЗОТИСТОГО ОБМЕНА

УПОМЕСНЫХ И ЧИСТОПОРОДНЫХ ОВЕЦ

ВПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ

;Биохимическая природа высокой продуктивности овец должна быть одинаковой независимо от метода их получения: путем скрещивания или отбора, потому что она в обоих случаях выражается большим накоплением важнейших биополимеров (белков, жиров", углеводов и их комплексов) в результате их усиленного синтеза при непосредственном участии ферментов.

Основа высокой продуктивности, как и все наследственные признаки, хотя закладывается заранее, но реализуется в постнатальном онтогенезе. Поэтому познание закономерностей накопления биополимеров, их внутренней взаимосвязи и изменения в онтогенезе позволило бы нам в раннем периоде не по всем, а хотя бы по отдельным легкодоступным показателям прогнозировать эти качества. Таким показателем при прогнозировании продуктивных качеств животных является состав крови. Для этой цели исследователи рекомендуют различные тесты: уровень кальция—для прогнозирования яйценоскости кур, содержание азота и альбумина — при селекции крупного рогатого скота. Установлена корреляция между содержанием глобулинов в сыворотке крови и массой овец (Карабалин, 1966). В последние годы некоторые исследователи рекомендуют в качестве дополнительных тестов при селекции животных использовать ферменты их крови (Смирнов, 1974).

Хотя в некоторых случаях наблюдается корреляция между различными хозяйственно полезными признаками и показателями крови, нам пока неизвестна их связь с таковыми в различных тканях. Накопление их и определяет уровень продуктивности. Такими показателями являются белковые и азотистые веществу и некоторые ферменты их обмена. В связи с этим мы поставили задачу: изучить обмен белковых и азотистых веществ в сыворотке крови и скелетной мышце у помесных и чистопородных овец в постнатальном онтогенезе; исследовать характер связи между различными биохимическими показателями.

Для этой цели мы подобрали овец казахской тонкорунной породы и их помесей с породой линкольн по 4 головы из каждой группы. Подопытное поголовье исследовали в суточном, 1-, 2-, 4- и 12-месячном возрастах, у которых после забоя в указанных тканях определяли содержание общего, белкового и остаточного азота, растворимые белки и их фракции методом электрофореза на полиакриламидном геле, а затем элюировали диметилсульфоксидом отдельные фракции.

Растворимые белки скелетной мышцы экстрагировали фосфорным буфером с рН 7,73 и ионной силой 0,1 после гомогенизации в гомогенизаторе Нош. 302 (Венгрия) при 10—12 тыс. об/мин (Кармолиев, 1971).

Количество белков в экстрактах мышц и сыворотке крови определя;

ли методом Лоури, содержание различных форм азота — по Кьельдалю, Сравнение данных, полученых методом, Лоури и рефрактометрически,, показывает, что при втором методе получаются заниженные показатели по сравнению с первым. В данной работе для сравнимости полученных результатов в исследуемых тканях использовали первый метод.

Белки мышц можно подразделить на белки саркоплазмы, миэфибрилл и стромы. Первые по своим физико-химическим свойствам разделяются на белки миоальбумина, миогена и глобулина. Все эти

на три группы по изоэлектрической точке (ИЭТ). И. И. Иванов и соавт.

«миоген» также является собирательным понятием. При электрофорезе

Мы фракционировали белки сыворотки крови и мышц на полиакриламидном геле, поэтому для идентификации измеряли расстояние от мет-

мина, а в отдельные возрастные периоды появляется постальбумин. Однако все эти фракции были объединены в одну первую. У более взрос-

несколько отличаются по возрастной динамике. Содержание раствори-

ной ткани чистопородных овец содержание белка у 2- и 4-месячных животных несколько выше, чем у помесеш Выход растворимого белка колеблется от 5,4 до 10%.

Данные, приводимые различными авторами, значительно отличаются. Так, по Н, Н. ЛУеЬег (1957), в поперечнополосатой мускулатуре со- - держатся до 38°/о водорастворимых белков. Сюда попадают и водораст- ' Еордмые.белки миофибрилл. По данным Н. Н. \УеЬег (1957), на долю

держания миоальбумина на ранних стадиях онтогенеза у иных видов животных сообщают и другие исследователи (Иванов и др., 1956).

На долю глобулина %, по данным Н. Н. ШеЬег (1958), приходится около 20% всего белкового азота, мышечной ткани. В'соке поперечнополосатых мышц содержится около 12—13% водорастворимых глобулинов. У наших животных Вторая фракция, соответствующая глобулину по подвижности, составляет 4,7—5,9% у новорожденных, достигая максимума 25,0% в 12-месячном возрасте.

Азотистые вещества сыворотки крови , и скелетной мышцы также претерпевают соответствующие изменения в связи с возрастом. Содержание общего азота, в сыворотке крови увеличивается с возрастом и доходит до максимальной величины в 12-месячном возрасте (табл. З).По-

месные и чистопородные ярки* достоверно не отличаются по их содержанию, но имеют некоторое различие в возрастной динамике, заключающейся в волнообразном изменении их содержания у помесей, тогда как у чистопородных оно все время увеличивается. Содержание общего азота в скелетной мышце у новорожденных ягият очень высокое и колеблется в пределах 1432—1540 мг%; у чистопородных оно к месячному возрасту уменьшается и в дальнейшем до 4-месячного возраста увеличивается, достигая своей максимальной'величины (1743 мг%). У помесей уровень азота остается на том же уровне, что и у 1- и 2-месячных, который несколько увеличивается у 4-месячных животных. В мышце общий азот у помесей в начальные периоды роста имеет тенденцию к увеличению.' Содержание общего азота сыворотки крови имеет высокую коррелятивную связь с таковой у скелетной мышцы и изменяется с возрастом. Например, в одномесячном возрасте отмечается прямая положительная связь (+0,87±0,09), а в 2- и 4-месячном возрастах.— отрицательная: соответственно 0,88+0,12, —0„9+0,1.

Возрастная динамика содержания растворимых белков мышц напоминает такую же картину общего белка, в сыворотке крови. При этом прямую положительную связь они Имеют при рождении, в 4- и 12-ме- сячном возрасте. Таким образом, отмеченная выше корреляция общего азота мышц и растворимых белков с одной стороны и азотом й белком

сыворотки крови с другой указывает на тесную связь между ними, зави-