bioxim-t 15

дуют остатки ДНК (при 0,75 М); РНК выходит в виде большого пика, извлекаемого солью при концентрации 0,9 М (рис. 1).

Определение количества НК в каждом пике и вычисление соотношения отдельных компонентов тотальной РНК показывают (табл. 1), что в порядке выхода из колонки относительная доля указанных компонентов составляет в среднем 16,5, 11,5 и 72,0% (рис. 1). Как видно из представленных материалов, сравниваемые животные почти не отличаются по относительному содержанию тРНК и остатков ДНК. В то же время оказалось, что количество рРНК заметно больше в тканях помесных овец, чем у чистопородных.

ши.т

Рис. 1. Хроматографическое разделение тотальной РНК пе-

Возможности хроматографического метода, конечно, ограничены по сравнению с электрофоретическим в полиакриламидном геле. Поэтому представленные в табл. 1 материалы следует считать ориентировочными и, безусловно, нуждающимися в дальнейшей проверке. Тем не менее, они указывают на то, что разные типы клеточной РНК содержатся в различных количественных соотношениях у животных в зависимости от

происхождения. Это, вероятно, свидетельствует о разном уровне синтеза этих веществ в клетках таких особей. В связи с этим представляют большой интерес результаты исследований других авторов, изучавших другие объекты с применением разных методов. В ряде работ показано (Конарев и др., 1971; Шахбазов, Шестопалова, 1971), что функциональная активность и число ядрышек, а также интенсивность синтеза рРНК в клетках гетерозисных гибридов лука и кукурузы значительна выше, чем у их исходных форм. Поскольку гены рРНК имеют полицистронную природу (Георгиев, 1973), резонно предположить, что у гетерозисных организмов по сравнению с их. родительскими формами увеличено число шовторов рДНК. Это подтверждается исследованиями Ш. Я. Гилязетдинова и соавт. (1976), показавших методом гибридизации ДНК — рРНК, что в клетках зоны растяжения корней-и целых 2—8-дневных гибридных растениях рДНК содержится больше, чем в родительских формах.

Наши данные, полученные на помесных и чистопородных овцах с

во у животных разного возраста и происхождения. Число нуклеотидов, содержащих аминогруппу в 6 положении (А+Ц), примерно равно числу нуклеотидов, содержащих 6-кетогруппу (Г+У). По составу все исследованные РНК принадлежат к ГЦ-типу. Коэффициент специфичности колеблется, в узких пределах (1,72—1,87), что, вероятно, подтверждает существующую точку зрения на отсутствие изменений в структуре генома гибридных организмов. В этой связи Ф. М. Мухамедгалиев (1975) пишет: «... ввиду того, что при гетерозисе не происходит заметной перестройки генома, а также возникновения «чего-то нового» в генетическом материале потомства фактор гетерозиса не проявляется в последующем скрещивании. Поэтому гетерозис выступает как однократный эффект, не имеющий своего генетического продолжения».

Конечно, исходя из данных о суммарном нуклеотидном составе РНК, трудно судить об особенностях строения генетического материала клетки. В ряде работ показано (Ивлева, 1975), что по УФ-поглощению заметные различия в нуклеотидном составе тотальной «немеченой» РНК у родительских линий и их гибридов не обнаруживаются. При определении же состава новообразованных РНК выявлены достоверные различия, которые объясняются разной скоростью синтеза тРНК и рРНК. Надо полагать, что гораздо большую информацию могут дать исследования структуры самого генетического материала, однако до с.йх пор данных по этому вопросу нет. Изучение состава ДНК и ее строения в связи с рассматриваемой проблемой представляет большой теоретический интерес. Остается надеятся, что в недалеком будущем некоторые детали этого вопроса прояснятся в соответствии с прогрессом методов исследований нуклеиновых кислот.

ЛИТЕРАТУРА

Ванюшин Б. Ф. Определение нуклеотидного состава нуклеиновых кислот. — В кн.: Современные методы биохимии. Том 1. М., 1964.

Георгиев Г. П. О структуре единиц транскрипции в клетках эукариотов. — В кн.: Успехи биологической химии, 1973, т. 14, № 1, с. 3—46.

Гилязетджов Ш. Я., Вахитова В. А., Яхин И. А. Повторяемость цистронов рРНК у гетерозисных гибридов растений. — Цитология и генетика, 1976, т. 10, № 4, с. 312—316.

Ивлева Л. А. Нуклеиновые кислоты гетерозисных гибридов кукурузы и их родительских форм (новообразование и фракционный состав). Автореф. канд. дис. Л., 1975.

о! пЬопис1ею асЫ. — Х ВЫ. СЬет., 1963, V. 238, N 9, р. 3065—3067.

УДК 591.1584-576.31

А. С. САРСЕНОВ, Е. Е. ЕРТАЕВ

ИЗУЧЕНИЕ ОСНОВНЫХ ТИПОВ ЯДЕРНЫХ БЕЛКОВ У ОВЕЦ В СВЯЗИ С ВОЗРАСТОМ И ПОРОДНОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТЬЮ

Новейшие данные молекулярной биологии позволяют утверждать, что в структуре хромосомы находятся контролирующие элементы., которые обеспечивают избирательную транскрипцию генов. Такими элементами в клеточных ядрах могут быть белки, на возможные функции которых в регуляции генной активности хроматина указывается: во многих рабс/тах (Боннер, 1967; Гердон, 1977). В связи с этим представляет •большой интерес изучение ядерных белков у различных организмов. Важное значение при этом отводится, естественно, хромосомным белкам, которые находятся в комплексе с генетическим материалом клетки, т. е. с ДНК.

Изучение ядерных белков может быть полезным и для расшифровки молекулярных механизмов гетерозисного эффекта, так как сейчас накапливается больше данных в пользу того, что первопричины гетерозиса заключены в регуляции геномов гибридных организмов. Есть некоторые сведения об уровне содержания отдельных ядерных белков в клетках гибридных и линейных мышей (Ходорова, Шерешевская, 1974; Шерешевская и др., 1977). Тем не менее, имеющиеся данные все же недостаточны для получения представления об особенностях в содержа^ нии и свойствах основных типов ядерных белков у гетерозиготных животных.

Цель настоящей работы — изучение уровня содержания и соотношения глобулиновых, кислых, гистоновых, негистоновых и остаточных, белков в ядрах клеток печени помесных и чистопородных овец, отличающихся скоростью роста и развития в течение некоторых периодов лостнатального онтогенеза.

точные* белки, которые извлекали горячей щелочью. Количество различ-

ных белков определяли по Лоури, используя в качестве ^стандарта; растворы сывороточного альбумина и тотального гнетена, выделенного нами из тимуса овцы по методу Е, "М. ,1о11п$ (1964) . По разнице в содержаниях общего ДНП и гистона находили количество негистоновых бел-, ков. Результат определений рассчитывали как на единицу сырой массы ядер, так и на 1 мг ДНК. Содержание' последней определяли по ранее описанной методике (Сарсенов, Ертаев, 1976).

Результаты исследований

Из таблицы 1 видно, что помеси на протяжении первых месяцев жизни имеют массу тела на 20—40% большую, чем их чистопородные сверстники. Масса печени у помесей также на 14—36% больше. К 1 году различия между этими животными в основном сглаживаются. Таким образом, помесный молодняк растет и развивается интенсивнее чистопородных сверстников.

Определение концентрации белков в глобулиновой фракции ядер показывает (табл. 2), что доля их в сумме ядерных белков колеблется в пределах 6—26% в зависимости от возраста животных. Содержание глобулиновых белков по мере роста и развития овец резко уменьшается." Например, к годичному возрасту оно составляет менее половины уровня,.

Т а б л и ц а 2., Концентрация белков в глобулиновой фракции клеточных ядер печени овец

свойственного интенсивно растущим ягнятам (1—2 мес). Такое же из-^ менение с возрастом отмечается и по относительной концентрации глобулиновых белков, рассчитанной на единицу массы ДНК. Таким образом, концентрация гетерогенных белков, объединенных под общим;, названием «глобулиновой фракции», в ядрах клеток печени овец: подвержена закономерному изменению в процессе постнатального развития.

По имеющимся в литературе данным, эта фракция ядерных белков кроме глобулинов в значительном количестве содержит растворимыеядерные ферменты (АЛепзо, АгпоЫ, 1973) и белки ядрышковых рибосом (Ревич и др., 1975). Поэтому в периоды наиболее быстрого роста ягнят (1—2 мес) в клеточных ядрах содержится значительно больше этих, групп белков, чем на последующих этапах их развития (12 мес). Такая прямая связь концентрации глобулинов и других растворимых белков, ядер с интенсивностью роста ягнят свидетельствует о том, что данная' белковая фракция имеет важное физиологическое значение. В частности, по уровню содержания этих белков в ядрах можно, по-видимому,, судить о биосйнтетических процессах в клетках.

Из сравнительного анализа показателей помесных и чистопородных, животных следует (см. табл. 2), что почти на всех возрастных этапах содержание белков в глобулиновой фракции ядер заметно больше у помесей. Правда, указанные различия характеризуются низкими критериями значимости, обусловленными, вероятно, значительной вариабельностью изучаемых показателей. Тем не менее, аналогичная тенденция отмечается и при рассмотрении относительных значений этих белков, вычисленных от суммы ядерного белка. Все это дает основание считать,, что глобулиновой фракции белков больше содержится в ядрах клеток помесных овец, чем чистопородных, и, следовательно, у первых биосинтетические процессы более интенсивны.

Содержание остаточных белков с возрастом увеличивается (табл. 3). Например, если в период интенсивного роста ягнят доля их составляет 15%, то к годичному возрасту она возрастает до 32% от всего ядерного белка. Концентрация их, рассчитанная на единицу массы ядер и ДНК, изменяется за тот же период более чем в 3 раза. Таким образом, по мере роста и развития животных в ядрах клеток в значительном количественакапливаются физиологически инертные денатурированные белки„ представленные главным образом протеиноидом соединительной ткани— коллагеном (Буш, 1967).

Т а б л и ц а 3. Концентрация остаточных белков в ядрах клеток печени овец

Сравниваемые генотипические группы животных существенно не отличаются по уровню содержания остаточных белков в ядрах (см. табл. 3). Между тем в 2- и 4-месячном возрасте показатель помесных ягнят значительно ниже (на 26—34%) такового у чистопородных сверстников. Причем эта разница статистически достоверна (Р<0,01).

Определение кислых белков, не связанных с хроматином, в ядрах клеток печени овец показывает (табл. 4), что содержание этих белков с возрастом увеличивается. Особенно резкое их изменение отмечается в ядрах клеток у 12-месячных животных. Такая картина наблюдается й в отношении концентрации кислых белков в ^расчете на единицу массы

.ДНК, которая возрастает от 0,4 до 2,5. Доля этих белков в суммарном ядерном белке у растущих животных колеблется в пределах 16 21% и почти в 2 раза возрастает к годовалому возрасту (32%). Сопоставление результатов, полученных при исследовании помесных и чистопородных животных, свидетельствует, что они по уровню концентрации кис- -лых белков в ядрах существенно не отличаются. Наблюдаемые в отдельных возрастах колебания в их содержании имеют низкие критерии

..значимости.

Значение кислых белков состоит в том, что они (аналогично нетистоновым белкам хроматина) выполняют важную роль в контроле синтеза ДНК и клеточной пролиферации. Эта группа гетерогенных белков, -объединяемых общим для них химическим свойством —• растворимостью в слабых щелочных растворах—-и поэтому носящих название кислых белков, присутствует в ядре в очень высоких концентрациях (Буш, 1967), что подтверждается и нашими данными (см. табл. 4). В состав этих •белков входят белки остаточных хромосом и ядрышек, являющихся местом синтеза рибосомной РНК (Збарский, Георгиев, 1959). В свете этих данных можно объяснить следующие факты. В годовалом возрасте, несмотря на значительное снижение скорости роста, в организме происходят сложные перестройки различных тканевых систем, связанные с переходом организма во взрослое состояние и началом его половой функции (Мухамедгалиев, 1970). Кроме того, усиливаются потребности организма в биосинтетических процессах, направленных на -обеспечение роста шерстных волокон, которые состоят главным образом из белка-кератина. Все эти факторы вместе взятые и вызывают, очевидно, увеличение активности генетического аппарата клетки, что сопряжено, по-видимому, с накоплением в клеточных ядрах кислых белков. Мы располагаем и другим, пока неопубликованным, экспериментальным материалом, подтверждающим эту точку зрения. В частности, данные, лолученные при изучении состава различных фракций хроматина печени у овец, показывают, что к годовалому возрасту заметно увеличивается доля активно транскрибируемых участков хроматина.

Среди ядерных белков особо важное значение отводится хромосомным белкам — гистонам и негистоновым белкам (НГБ), которые находятся в комплексе с генетическим материалом клетки, т. е. с ДНК. В сумме эти белки носят название дезоксирибонуклеопротеида (ДНП), который является материальным субстратом наследственности. Изучение уровня содержания этих групп белков показывает, что он с возрас-

том существенно изменяется (табл. 5). Наибольшее содержание ДНП отмечено в 4-месячном возрасте, когда оно более чем в 1,5 раза превышает уровень его у новорожденных ягнят. К годовалому возрасту этот показатель хотя и несколько снижается, но находится на довольно высоком • уровне, о чем свидетельствуют данные о концентрации ДНП в расчете'на 1 мг ДНК. Белки, связаные с ДНК, имеют наибольший удельный вес среди других ядерных белков. Так, их доля колеблется в пределах от 30 до 49% в зависимости от того, в каком возрасте изучен белковый состав клеточных ядер. Больше всего относительное содержание ДНП в ядрах клеток растущих ягнят и несколько ниже у взрослых овец* Даже у последних количество его составляет почти треть всего ядерного белка.

Т а б л и ц а 5. Концентрация общего ДНП в клеточных ядрах печени овец

Показатели чистопородных и помесных овец существенных различий между собой не имеют, за исключением 2-месячного возраста, когда содержание ДНП у помесей несколько выше, чем у чистопородных сверстников.

Анализ материалов, помещеных в таблицах 5 и 6, свидетельствует, что возрастной сдвиг уровня ДНП обусловлен изменением содержания НГБ. Доля последних в ДНП находится в пределах 35—62%, т. е. в ко-

Т а б л и ц а 6. Концентрация НГБ в клеточных ядрах печени овец

личественном отношении НГБ несколько превышают уровня содержания гистона (табл. 7). Последний с возрастом существенно не изменяется и присутствует в ядрах почти в эквимолярных концентрациях по отношению к ДНК (0,9—1,2). Таким образом, наиболее лабильным компоненсом хромосомы являются негистоновые белки, которым, согласно имею-

щимся данным (Ревич и др., 1975; Уманский,' 1976), отводится роль специфических регуляторов транскрипции. Подобно кислым белкам, НГБ состоят из различных белков; из них некоторые, по-видимому, могут служить физиологическими «нейтрализаторами» избыточного количества гистонов (Ревич и др., 1975), тем самым они являются своего рода дерепрессорами или активаторами генной активности. Исходя из этих данных, а также материалов, полученных в настоящей работе (табл. 6), можно сделать заключение о том, что негйстоновые белки в ядрах клеток печени подвержены закономерным изменениям в процессе развития и межпородного скрещивания овец. Увеличение уровня содержания этих белков в период наиболее интенсивного роста ягнят можно: сопоставить с адэкватным усилением матричной активности генетического аппарата их клеток. В этой связи наибольший интерес представляют результаты сравнительного изучения содержания НГБ в ядрах клеток помесных и чистопородных животных. Как видно из табл. 6, концентрации этих белков по отношению к ДНК заметно выше у помесных ягнят. Кроме того, у помесей ДНП в значительной степени представлен НГБ, а не гистонами. Поэтому отмеченное следует считать позитивным явлением, свидетельствующим о высоком уровне биосинтетических процессов в ядрах клеток овец помесного происхождения.

Как уже говорилось выше, содержание гистона не подвержено возрастному изменению (табл. 7). В то же время отмечается, что относительная доля гистонов в сумме ядерных белков имеет тенденцию к снижению с возрастом (от 26% в 1 месяц до 13% в 12 мес), а отношение гистона к ДНК более, или менее стабильно. Это свидетельствует о том, что содержание гистонов если и изменяется, то происходит соразмерно с изменением уровня концентрации ДНК в ядрах. Но поскольку последняя в расчетё на ядро есть сравнительно постоянная величина, то и уровень гистонов на ядро, надо полагать, является стабильным показателем. На это же указывают данные, полученные при сравнительном определении гистона у чистопородных и помесных овец. Помеси в этом отношении мало чем отличаются от контрольных животных (см. табл. 7). Таким образом, по уровню содержания неспецифических репрессоров генной активности (гистонов) животные разного возраста и породного происхождения существенно не отличаются.

Ранее мы показали (Сарсенов, Ертаев, 1976), что количество некоторых фракций гистона, особенно лизинбогатого, заметно меньше в ядрах клеток печени и тимуса помесных овец, чем у чистопородных. По-' этому необходимы в этом отношении дополнительные исследования, которыми мы в настоящее время и занимаемся.

Подытоживая результаты представленных в данной работе исследований, можно отметить следующее. Исследовано содержание и соот-'

ношение 5 основных классов ядерных белков (глобулины, остаточные белки, кислые белки, не связанные с хроматином, негистоновые белю» хроматина и гистоны) в гепатодитах овец разного возраста и генотипа. Показано, что эти белки подвержены определенным изменениям как в процессе развития животных, так и при межпородном скрещивании. Выявлена связь уровня концентрации некоторых белков (кислые, негистоновые и глобулиновые белки) с ростом и развитием овец, показан различный состав ядерных белков для клеток помесных и чистопородных животных.