4.7. Молекулярні основи синтезу антитіл

У 1965 р. В. Дрейєр та Дж. Беннет висловили припущення про те, що молекули імуноглобулінів, можливо, синтезуються не на одній генній ділянці, а на декількох, а також, що існує кілька V-сегментів, що кодують паратопи антитіл. Це питання зацікавило вчених тому, що було незрозуміло, яким чином на обмеженій кількості генів у хромосомах може експресуватися колосальна кількість антитіл з різною специфічністю.

Розкриття таємниці цього явища стало можливе завдяки дослідженням Сусумі Тонегави, проведеним у 1975 – 1976 рр. Здійснюючи аналітичний електрофорез з метою розділення рестриктів ДНК з незрілих та активованних В-лімфоцитів, він виявив різницю у складі генів імуноглобулінів. Це пов’язано з рекомбінаціями, які відбуваються в процесі дозрівання В-лімфоцитів на рівні ДНК (транслокація генів), а також на рівні попередниці і-РНК (шляхом сплайсингу). Таким чином, С. Тонегава встановив, що гени імуноглобулінів розчленовані, складаються з великої кількості кодуючих сегментів (екзонів) і некодуючих ділянок (інтронів). У результаті рекомбінації у кожному певному В-лімфоциті відбувається перетасовування генетичного матеріалу з унікальною комбінацією сегментів, що дуже важливо для розпізнавання безлічі різноманітних антигенів. В усіх клітинах тіла, навіть у стовбурових кровотворних клітинах, гени імуноглобулінів назавжди залишаються в розірваному стані, який називають зародковою конфігурацією (germline configuration). Геном таких лімфоцитів також називають зародковим. Ці лімфоцити називають некомітованими, або LN (limfocite naive) чи LV (limfocite virgine). Але як тільки лімфоцит зустрінеться з антигеном, що має спорідненість з паратопом, починається процес імуногенезу, що зводиться до дозрівання його генома. Такі лімфоцити називаються комітованими – запрограмованими на синтез антитіл із заданою специфічністю. Тільки у В-лімфоцитах, які активуються антигеном на ранніх стадіях їх диференціювання починається складний генетичний процес об’єднання сегментів ДНК, який отримав назву соматичної рекомбінації. У стовбурових кровотворних клітинах і у В-лімфоцитах, що утворюються з них, але ще не зустрічалися з антигеном, не відбувається перекомбінації і сплайсингу, тому їх геном називається зародковим, чи ембріональним. Механізм цієї рекомбінації є запрограмовано випадковим. У сьогоденні вже відомо 120 генів, відповідальних за синтез імуноглобулінів. У різних комбінаціях вони здатні давати 10¹⁶ варіантів антитіл з різною специфічністю. Це можливо за рахунок таких подій:

1) транслокації ДНК – це рекомбінації, пов’язані з видаленням деяких інтронів у самій молекулі ДНК. Цей процес є унікальним і характерний тільки для генів імуноглобулінів у В-лімфоцитах. ДНК, що містить екзони та всі інтрони, називається ембріональною чи зародковою. Після транслокації, яка пов’язана з вирізанням інтронів та з’єднанням кодуючих сегментів, гени імуноглобулінів називають зрілими;

2) сплайсинг на рівні попередниці і-РНК (про-і-РНК) з вирізанням великого інтрона між сегментами, які кодують варіабельну та константну частину імуноглобулінів;

3) супермутагенез, який здійснюється у ДНК плазмоцитів (нащадків активованних антигеном В-лімфоцитів) і дуже рідко виправляється ферментами репарації. Частота такого мутагенезу становить 10 ^–3;

4) неповні чи неправильні транслокації та сплайсинги, які відбуваються зі зміщенням рамки зчитування.

Важливу роль у вивченні молекулярних механізмів синтезу антитіл відіграли такі методи генетичної інженерії, як рестрикційний аналіз, клонування генів, одержання моноклональних антитіл, роботи з плазмоцитами мишей.

Структуру генів імуноглобулінів детально вивчено у різних ссавців. Окремі сегменти були молекулярно клоновані, визначено їх чисельність. Відповідно до кодування тих чи інших ділянок молекули імуноглобулінів їх гени поділені на групи сегментів (кластери): V-сегменти кодують варіабельну частину імуноглобулінів (приблизно 1 – 95 амінокислоти), J-сегменти (joining) – кінцеву ділянку паратопів (96 – 108 амінокислоти), С-сегменти – константну частину молекули антитіла. Це стосується розподілу кластерів легких ланцюгів (κ і λ). У кодуванні важких ланцюгів бере участь ще один кластер сегментів – D (diversity), який розташований між V- і J-групами та забезпечує додаткову різноманітність паратопів антитіл. Загальні формули генних послідовностей, які кодують легкі і важкі ланцюги імуноглобулінів у ссавців, будуть виглядати, відповідно, таким чином: 5΄‑ L – V – J – C ‑ 3΄ і 5΄‑ L – V – D ‑ J – C ‑ 3΄, де L – ген лідерного пептиду, що пізніше відрізається.

Гени, що кодують  κ-ізотипи легких  ланцюгів (L), локалізовані у людини в  2-й хромосомі, гени λ-ізотипів L-ланцюгів – у 22-й, гени важких ланцюгів (Н) всіх ізотипів – у 14-й хромосомі.

Більшість досліджень було проведено на плазмоцитомах мишей, тому більш за все вивчено гени імуноглобулінів миші. Їх розташування у хромосомах має багато спільного з геномом людини, але відрізняється кількістю сегментів, що кодують варіабельні домени. Розглянемо будову генної ділянки, що кодує κ-ланцюг мишачого імуноглобуліну. Гени κ-ланцюга містяться у 6-й хромосомі і включають 3 кластери: V, J, С. З 5΄-кінця, перед V-кластером розташована послідовність L, що кодує лідерний пептид, необхідний для секреції імуноглобулінів з клітини. Після невеликого інтрона в ДНК розміщується V-кластер, який складається з 400 сегментів і кодує 1 – 95 амінокислоти V-домена. На відстані 1300-1400 пар нуклеотидів від нього знаходиться J-кластер, що включає 5 сегментів (третій з них не функціонує), які кодують 95 – 110 амінокислот (96 – 98 амінокислотні залишки входять до складу третьої гіперваріабельної петлі активного центру). На відстані 2500-4500 пар нуклеотидів від J-групи знаходиться С-сегмент, що кодує константний домен легкого ланцюга.

На першому етапі дозрівання генома В-лімфоцита відбувається рекомбінація на рівні ДНК, внаслідок чого будь-який V-сегмент з’єднується з одним із чотирьох J-сегментів (VJ-рекомбінація). При цьому вирізаються інтрони і зайві V- і J-сегменти. Здійснюють цей процес спеціальні рекомбінази, знаходячи сайти (ділянки) вирізання за наявністю специфічних сигнальних послідовностей, розташованих по краях екзонів. Ділянки, які розпізнаються рекомбіназами, включають групу «гептамер – спейсер – нонамер», або її інвертований повтор. Послідовності гептамерів і нонамерів досить консервативні. Так, гептамер має частіше за все такий склад нуклеотидів – CACAGTG, нонамер – ACAAAAACC.

На другому етапі дозрівання генома після переписування інформації з частково рекомбінованої ДНК на про-і-РНК відбувається додатковий сплайсинг з вирізанням інтрона між L-послідовністю і V-кластером, а також великого інтрона між J- і C-кластерами.

Гени, що кодують λ-ланцюг мишачого імуноглобуліну, розташовані у 16-й хромосомі. Вони включають лідерну послідовність L; V-кластер, до якого входять два сегменти; J-кластер з чотирма функціонуючими сегментами; чотири С-сегменти, кожному з яких відповідає певний J-сегмент. Рекомбінація і сплайсинг при дозріванні λ-ланцюга відбуваються так, як і у κ-ланцюга. Таким чином, зародкові гени κ- і λ-ланцюгів у геномі миші будуть виглядати так:

κ-ланцюг: V-сегментів – 400, J-сегментів – 5 (4 функціонують), С-сегментів – 1.

λ-ланцюг: V-сегментів – 2, J-сегментів – 4, С-сегментів – 4.

Кількість можливих варіантів L-ланцюгів буде становити:

N_κ= V₄₀₀ × J₄ × С₁ = 400 × 4 × 1 = 1600

N_λ= V₂ × J₄(С₄) = 2 × 4 = 8

Щодо кількості генних сегментів, що кодують κ- та λ-ланцюги людських імуноглобулінів, у різних джерелах наводяться різні дані:

κ-ланцюг: V-сегментів – 300 (або 40), J-сегментів – 4 (або 5), С-сегментів – 1.

λ-ланцюг: V-сегментів –1(або 30), J-сегментів – 6(або 4), С-сегментів – 6(або 1).

Найбільш складним є синтез Н-ланцюгів імуноглобулінів. У відповідній генній ділянці, на відміну від генів легких ланцюгів, з’являється додатковий кластер – D (від англ. diversity – різноманітність), що знаходиться між V- і J-кластерами. Структурні гени константних доменів антитіл розташовані в тих самих хромосомах, що і V-, D-, J-гени “нижче за течією” та ближче до 3´-кінця. Формула будови генної послідовності, яка кодує важкий ланцюг імуноглобуліну миші, буде такою: V_100-250D₁₀J₅C₉. Причому С-сегменти, які кодують різні ізотипи важких ланцюгів і визначають належність до певного класу чи підкласу імуноглобулінів, розташовані тандемно. Всього існує 9 ізотипів важких ланцюгів: 4 – для IgG (по одному для кожного підкласу), 2 – для IgA (для двох підкласів) та по одному ізотипу – для IgM, IgD, IgE. Структурні гени константних доменів важкого ланцюга імуноглобуліну розташовані у хромосомі у такій послідовності: у миші ‑ С_µ, С_δ, С_γ3, С_γ1, С_γ2b, С_γ2а, С_ε, С_α1, С_α2 (можлива наявність ще одного С-сегмента); у людини – С_µ, С_δ, С_γ3, С_γ1, С_α1, С_γ2, С_γ4, С_ε, С_α2. Хоча кількість С-сегментів відповідає загальній кількості класів і підкласів імуноглобулінів, хвостова ділянка імуноглобуліну кодується тільки одним відповідним йому сегментом гена. Слід відзначити, що в С-кластері першими розташовані С_µ- і С_δ-гени, які кодують імуноглобулінові рецептори В-лімфоцитів (IgM- і IgD-рецептори) і можуть експресуватися вже на рівні зародкового генома, коли відбувається дозрівання В-лімфоцитів з В-клітин-попередниць.

При синтезі важкого ланцюга в результаті рекомбінації ДНК спочатку видаляються зайві інтрони і зайві екзони між V- і D- та D- і J-сегментами (VDJ-рекомбінація), а після транскрипції на про-іРНК відбувається сплайсинг інтрона між лідерною послідовністю і V-сегментом, а також вирізання непотрібних фрагментів між J- і С-сегментами. Сплайсинг відбувається за допомогою особливих ферментів за специфічними ділянками – SR (від англ. svitch region – ділянка перемикання).

Кількість ймовірних варіацій важких ланцюгів імуноглобулінів мишей дорівнює:

N_H=V × D × J × С = 250 × 10 × 5 × 10 = 125000.

Враховуючи кількість ймовірних варіантів важких ланцюгів, а також легких – κ- і λ-ланцюгів, які можуть вільно комбінуватися, можливо приблизно визначити загальну кількість імуноглобулінів:

N_Ig=N_κ × N_λ × N_H = 1600 × 8 × 125000 = 16 × 10⁸.

За рахунок нечітких рекомбінацій та сплайсингів із зсувом рамки зчитування кількість варіантів легких і важких ланцюгів може значно збільшуватись – в 2-10 разів, а за деякими даними – у 100 і більше разів.