Молекулярная биология клетки. Том 1
.pdf
431
свою собственную ДНК, кодирующую некоторые белки этих органелл. Однако к настоящему времени митохондрии и хлоропласты утратили большую часть собственного генома и стали полностью зависеть от белков, кодируемых ядерными генами, синтезируемых в цитозоле и лишь затем переносимых в органеллу. И наоборот, клетки-хозяева стали зависимы от этих органелл, дающих значительную часть АТР, необходимого для биосинтезов, активного транспорта ионов и растворенных веществ и двигательных функций, а также содержащих ряд ферментов, катализирующих некоторые реакции биосинтеза.
7.1. Митохондрии
Митохондрии занимают значительную часть цитоплазмы почти во всех эукариотических клетках. Хотя митохондрии настолько велики, что их можно увидеть в обычный световой микроскоп, и впервые были обнаружены еще в прошлом веке, все же реальная возможность разобраться в их функции появилась только после 1948 г., когда были разработаны методы выделения интактных митохондрий. По техническим причинам большинство биохимических исследований проводилось на митохондриях, выделенных из печени.
Митохондрии обычно изображают в виде жестких вытянутых, похожих на бактерии цилиндров диаметром от 0,5 до 1 мкм. Однако цейтраферная микрокиносъемка живых клеток позволяет увидеть, что митохондрии - необыкновенно подвижные и пластичные органеллы, которые постоянно изменяют свою форму (рис. 7-2) и даже сливаются друг с другом и затем вновь разделяются. Пути перемещения митохондрий в цитоплазме часто связаны с микротрубочками (рис. 7-3), что может определять характерную ориентацию митохондрий и распределение их в различных клетках. В некоторых клетках митохондрии образуют длинные подвижные филаменты или цепочки, а в других они фиксированы вблизи мест высокого потребления АТР-например, в сердечной мышце они располагаются между миофибриллами, а в сперматозоидах плотно обвивают жгутик (рис. 7-4).
7.1.1. Митохондрии имеют наружную и внутреннюю мембраны, образующие два внутренних компартмента [2]
Каждая митохондрия окружена двумя высокоспециализированными мембранами, играющими ключевую роль в ее активности. Мембраны
Рис. 7-2. Быстрое изменение формы митохондрий, наблюдаемое в живых клетках.
Рис. 7-3. А. Световая микрофотография цепочек вытянутых митохондрий в живой клетке в культуре ткани млекопитающего. Клетка обработана витальным флуоресцентным красителем (родамином 123), специфически окрашивающим митохондрии. Б. Иммунофлуоресцентная микрофотография той же самой клетки, обработанной (после фиксации) флуоресцентными антителами к микротрубочкам. Обратите внимание, что митохондрии располагаются в основном вдоль микротрубочек. Масштабный отрезок 10 мкм. (С любезного разрешения Lan Во Chen.)
432
образуют два изолированных митохондриальных компартмента: внутренний матрикс и значительно более узкое межмембранное пространство. Если очищенные митохондрии осторожно разрушить и затем разделить на фракции (рис. 7-5), можно определить биохимический состав
каждой из двух мембран и заключенных между ними пространств. Как показано на рис. 7-6, каждая фракция содержит уникальный набор белков. В состав наружной мембраны входит много копий белка, называемого порином, который образует широкие гидрофильные каналы в
липидном бислое. Таким образом, эта мембрана напоминает сито, проницаемое для всех молекул массой 10000 дальтон и меньше, включая небольшие белки. Эти молекулы могут проникать в межмембранное пространство, но большая их часть не способна проходить через непроницаемую внутреннюю мембрану. Это означает, что если химический состав межмембранного пространства эквивалентен составу цитозоля хотя бы в отношении молекул малого размера, то матрикс содержит гораздо более ограниченный набор небольших молекул.
Как будет подробнее описано позже, основная рабочая часть митохондрии - это матрикс и окружающая его внутренняя мембрана. /Внутренняя мембрана высокоспецифична, она содержит большое количество «двойного» фосфодипида кардиолипина (разд. 7.5.15), что как полагают, и делает мембрану особенно непроницаемой для ионов. В состав внутренней мембраны входят также разнообразные транспортные белки, обусловливающие ее избирательную проницаемость для тех малых молекул, которые либо метаболизируются многочисленными ферментами, сконцентрированными в матриксе, либо необходимы для их активности. В частности, матрикс содержит ферменты, превращающие пируват и жирные кислоты в ацетил-СоА и затем окисляющие последний в цикле лимонной кислоты. Главные конечные продукты этого окисления - СО2, выходящий из клетки, и NADH, который служит главным источником электронов, переносимых дыхательной цепью - так называется электронтранспортная цепь митохондрий. Ферменты дыхательной цепи встроены во внутреннюю митохондриальную мембрану и необходимы для процесса окислительного фосфорилирования, дающего большую часть АТР в животных клетках.
Рис. 7-4. Локализация митохондрий вблизи мест высокого потребления АТР в сердечной мышце и в хвосте спермия. В ходе развития жгутика спермия микротрубочки обвивают аксонему и обеспечивают тем самым надлежащее расположение митохондрий.
Рис. 7-5. Методы разделения митохондрий на отдельные компоненты дают возможность изучать различные белки в каждом компартменте митохондрии. Представленный здесь метод, позволяющий одновременно обрабатывать большое количество митохондрий, основан на том, что в среде с низкой ионной силой вода проникает в митохондрию и вызывает сильное набухание матрикса. При этом кристы внутренней мембраны расправляются, а наружная мембрана, не имеющая складок, разрывается, высвобождая структуру, состоящую только из внутренней мембраны и матрикса.
433
Рис. 7-6. Общее строение митохондрии. В митохондриях печени 67% всего белка находится в матриксе, 21% - в наружной мембране, 6% - во внутренней мембране и 6% - в межмембранном пространстве. Каждый из этих четырех компартментов в соответствии со своей функцией содержит определенный набор ферментов (см. схему внизу). (Микрофотография любезно предоставлена Daniel S. Friend.)
434
7.1.2. Внутренняя мембрана образует складки - кристы [3]
Внутренняя мембрана обычно образует в матриксе сложную систему складок, называемых кристами. Эти складки значительно увеличивают площадь внутренней мембраны; например, в митохондриях печени внутренняя мембрана составляет третью часть всех мембран клетки (см. табл. 8-2). В митохондриях сердечной мышцы число крист в три раза больше, чем в митохондриях печени, что, по-видимому, связано с высокой потребностью клеток сердца в АТР. Кроме того, кристам митохондрий в различных клетках свойственны поразительные морфологические особенности, значение которых неизвестно (рис. 7-7).
Помимо морфологических особенностей разные типы клеток существенно различаются по составу митохондриальных ферментов. Однако в этой главе мы отвлечемся от различий и рассмотрим лишь ферменты и свойства, общие для всех митохондрий.
7.1.3. Окислительные процессы в митохондриях начинаются после образования в матриксе достаточного количества ацетил-СоА из пирувата и жирных кислот [4]
«Топливом» для окислительного метаболизма в митохондриях служат главным образом жирные кислоты и пируват, образуемый в результате гликолиза в цитозоле. Эти вещества избирательно транспортируются из цитозоля в митохондриальный матрикс, где распадаются до двухуглеродных групп, присоединенных к ацетилкоферменту А (ацетил-СоА, рис. 7-8). В составе молекулы ацетил-СоА каждая ацетильная группа поступает затем в цикл лимонной киcлоты для дальнейшего расщепления. Процесс заканчивается переносом по дыхательной цепи богатых энергией электронов, извлеченных из ацетильной группы.
Для того чтобы обеспечить непрерывное снабжение окислительного метаболизма «топливом», животные клетки запасают его в виде жиров, служащих источником жирных кислот, и гликогена - источника глюкозы. которая потом расщепляется до пирувата. В количественном отношении жиры гораздо более важны хотя бы потому, что при их окислении
Рис. 7-7. Некоторые морфологические различия в строении крист митохондрий, выделенных из разных тканей крысы. Значение этих различий для функционирования митохондрий не известно.
Рис. 7-8. Ацетил-СоА - главный промежуточный продукт, образующийся при расщеплении питательных веществ в митохондриях. На рисунке изображена пространственная модель этой молекулы (см. также рис. 2-19). S - атом серы, образующий с ацетатом тиоэфирную связь. Так как эта связь высокоэнергетическая, ацетатная группа может быть легко перенесена на другую молекулу, такую как оксалоацетат (см. рис. 7-14).
435
освобождается в шесть с лишним раз больше энергии, чем при окислении равного количества гликогена в его гидратированной форме. Запасов гликогена в организме среднего взрослого человека достаточно на один день нормальной активности, тогда как запаса жиров хватит на месяц. Если бы главным резервом топлива в нашем организме служил гликоген, а не жиры, вес тела увеличился бы в среднем на 25 кг.
Основная часть жировых запасов находится у нас в жировой ткани, откуда по мере надобности жиры транспортируются с током крови к остальным клеткам. Потребность в жирах возрастает после некоторого периода голодания; даже после ночного сна происходит мобилизация жира, так что в утренние часы большая часть ацетил-СоА, поступающего в цикл лимонной кислоты, извлекается из жирных кислот, а не из глюкозы. Однако после еды главным источником ацетил-СоА для цикла лимонной кислоты становится глюкоза, полученная с пищей. Избыток этой глюкозы идет на восполнение истощенных запасов гликогена или на синтез жиров. (Следует отметить, что хотя сахара в животных клетках легко переводятся в жиры, последние не могут превращаться в сахара.)
Молекула жира состоит из трех остатков жирных кислот, присоединенных эфирными связями к молекуле глицерола. Такие триацилглицеролы (триглицериды) неполярны и практически нерастворимы в воде - в цитозоле они образуют жировые капельки (рис. 7-9). В адипоцитах -- клетках жировой ткани - одна большая капля жира занимает почти весь клеточный объем; крупные жировые клетки специализированы для хранения жира. Мелкие жировые капельки обычны для таких клеток, как волокна сердечной мышцы, использующие энергию расщепления жирных кислот; жировые капли в этих клетках часто бывают тесно связаны с митохондриями (рис. 7-Ю). Во всех клетках ферменты наружной и внутренней мембран митохондрий участвуют в переносе жирных кислот, извлеченных из молекул жира, в митохондриальный матрикс. В матриксе каждая молекула жирной кислоты (в виде ацил-СоА) полностью расщепляется в цикле реакций, за каждый оборот которого она укорачивается с карбоксильного конца на два атома углерода и образуется одна молекула ацетил-СоА (рис. 7-11). Дальнейшее окисление ацетил-СоА происходит в цикле лимонной кислоты.
Гликоген представляет собой большой разветвленный полимер глюкозы, содержащийся в виде гранул в цитоплазме (рис. 7-12); синтез и распад гликогена с высокой степенью точности регулируется нуждами организма (см. разд. 12.4.1). При повышении потребности в глюкозе гликоген расщепляется с образованием глюкозо-1-фосфата. В процессе гликолиза шестиуглеродная молекула глюкозы (или родственного ей сахара) превращается в две трехуглеродные молекулы пирувата (см. разд. 2.3.2), еще сохраняющие большую часть энергии, которая может быть извлечена при полном окислении сахара. Эта энергия высвобождается только после переноса пирувата из цитозоля в митохондриальный матрикс, где пируват подвергается воздействию мультиферментного комплекса, который крупнее рибосомы, - пируватдегидрогеназного комплекса. Этот комплекс, содержащий множественные копии трех ферментов, пяти коферментов и двух регуляторных белков, быстро превращает пируват в ацетил-СоА (при этом в качестве побочного продукта выделяется СО2) (рис. 7-13). Этот ацетил-СоА, так же как и ацетил-СоА, образующийся при окислении жирных кислот, поступает в цикл лимонной кислоты.
Рис. 7-9. А. Электронная микрофотография жировой капельки, содержащей триацилглицеролы основную форму резервных жиров в цитоплазме. Б. Строение триацилглицерола; цветом выделен остаток глицерола. (Фото А любезно предоставлено Daniel S. Friend.)
Рис. 7-10. В клетках сердечной мышцы жировые капельки окружены митохондриями, в которых происходит окисление жирных кислот, извлекаемых из триацилглицеролов.
436
Рис. 7-11. Цикл окисления жирных кислот, этапы которого последовательно катализируются в митохондриальном матриксе четырьмя ферментами. За каждый оборот цикла молекула жирной кислоты укорачивается на два углеродных атома (выделены цветом) и образуется одна молекула ацетилСоА и по одной молекуле NADH и FADH2. NADH свободно растворяется в матриксе, в то время как FADH2 остается тесно связанным с ферментом ацил-СоА-дегидрогеназой; два электрона FADH2 быстро переносятся на убихинон, находящийся во внутренней мембране митохондрии (разд. 7.2.5), и при этом регенерируется NAD. Представленный здесь четырехступенчатый путь окисления жирных кислот идентичен по своей химической сущности расщеплению многих других углерод-углеродных связей (см., например, рис. 7-14).
Рис. 7-12. Электронная микрофотография и схематическое изображение гранул гликогена - главной резервной формы углеводов в клетках позвоночных. Гликоген - это полимер глюкозы, и каждая гранула представляет собой единственную сильно разветвленную молекулу. Синтез и расщепление гликогена катализируют ферменты, связанные с поверхностью гранул, в том числе гликогенсинтаза и расщепляющий фермент
гликогенфосфорилаза. (С любезного разрешения Robert Fletterick и Daniel S. Friend.)
437
Рис. 7-13. Реакции, осуществляемые пируватдегидрогеназным комплексом, превращающим пируват в ацетил-СоА в митохондриальном матриксе; в
ходе этих реакций также образуется NADH. А, В, С - это три фермента: пируватдегидрогеназа, дигидролипоил-трансацетилиза и дигидролипоил-
дегидрогеназа, функции которых сопряжены, как показано на рисунке. Строение комплекса изображено на рис. 2-40; комплекс содержит также протеинкиназу и протеинфосфатазу, которые регулируют активность пируватдегидрогеназы, «отключая» ее при высоких концентрациях АТР.
7.1.4. Окисление ацетильной группы до ацетил-СоА в цикле лимонной кислоты ведет к образованию молекул NADH и FADH2 для дыхательной цепи [5]
Еще в прошлом веке биологи заметили, что в отсутствие воздуха (в анаэробных условиях) клетки образуют молочную кислоту (или этанол), тогда как в аэробных условиях они используют кислород, образуя СО2 и Н2О. Усилия по выяснению путей аэробного метаболизма в конце концов сосредоточились на окислении пирувата и привели в 1937 г. к открытию цикла лимонной кислоты, называемого также циклом трикарбоновых кислот или циклом Кребса. В большинстве клеток в цикле лимонной кислоты происходит около двух третей всех реакций окисления углеродных соединений. Главные конечные продукты этого цикла - СО2 и NADH. CO2 выделяется как побочный продукт, а молекулы NADH передают свои богатые энергией электроны в дыхательную цепь, в конце которой эти электроны используются для восстановления О2 до
Н2О.
Цикл лимонной кислоты начинается с взаимодействия между ацетил-СоА, образованным из жирных кислот или пирувата, и четырехуглеродным соединением оксалоацетатом, в результате чего образуется шестиуглеродная лимонная кислота, которая и дала название всему циклу. Далее в ходе семи последовательных ферментативных реакций два атома углерода удаляются в виде СО2 и в конце концов регенерируется оксалоацетат. Каждый оборот цикла дает две молекулы СО2, образующиеся из двух углеродных атомов, поступивших в предыдущие обороты цикла (рис. 7-14). Превращение ацетильной группы в составе ацетил-СоА можно представить следующей суммарной реакцией:
СН3СООН (в виде ацетил-СоА) + 2Н2О + 3NAD+ + FAD, связанный с белком → 2СО2 + ЗН+ + 3NADH + FADH2, связанный с белком. Кроме того, в результате этой реакции синтезируется одна молекула АТР (через GTP) путем субстратного фосфорилирования, подобно
тому как это происходит при гликолизе (см. разд. 2.3.2).
Наиболее важный вклад цикла лимонной кислоты в метаболизм - это извлечение высокоэнергетических электронов, происходящее при окислении двух углеродных атомов в молекуле ацетил-СоА. Эти электроны связываются NADH и FADH2 и затем быстро передаются в дыхательную цепь во внутренней митохондриальной мембране. FADH2 - компонент сукцинатдегидрогеназного комплекса внутренней мембраны - передает свои электроны непосредственно в дыхательную цепь. В отличие от этого NADH образует растворимый пул восстанавливающих эквивалентов в матриксе и отдает свои электроны в результате случайных взаимодействий с мембраносвязанной дегидрогеназой. Рассмотрим теперь, каким образом энергия этих электронов используется для синтеза АТР.
438
Рис.7-14. Цикл лимонной кислоты. Промежуточные продукты представлены в виде свободных жирных кислот, хотя в действительности карбоксильные группы ионизированы. Каждая из показанных реакций катализируется особым ферментом; все эти ферменты находятся в матриксе митохондрии. Два углеродных атома, приносимые с ацетил-CoA, превращаются в СО2 в последующих оборотах цикла. Цветом выделены два углеродных атома, превращающиеся в СО2 уже в данном цикле. Кроме того, образуются три молекулы NADH. Образующаяся молекула GTP может быть превращена в АТР путем обменной реакции GTP + ADP → GDP + АТР. Молекула FADH2 остается в составе сукцинатдегидрогеназного комплекса, находящегося во внутренней мембране митохондрии; этот комплекс передает электроны с FADH2 непосредственно на убихинон.
7.1.5.На митохондриальной мембране энергия окислительных реакций преобразуется в результате хемиосмотического процесса
вэнергию АТР [6]
Хотя цикл лимонной кислоты составляет часть аэробного метаболизма, ни в одной из реакций этого цикла, приводящих к образованию NADH и FADH2, молекулярный кислород не принимает прямого участия; это происходит только в завершающей серии катаболических реакций, протекающих на внутренней мембране. Почти вся энергия, получаемая на ранних этапах окисления от сжигания углеводов, жиров и других питательных веществ, вначале запасается в форме высокоэнергетических электронов, переносимых NADH и FADH. Затем эти электроны взаимодействуют с молекулярным кислородом в дыхательной цепи. Так как большое количество высвобождаемой энергии используется ферментами внутренней мембраны для синтеза АТР из ADP и Рi, эти последние реакции называют окислительным фосфорилированием (рис. 7- 15).
Как уже упоминалось, синтез АТР в реакциях окислительного фосфорилирования, протекающих в дыхательной цепи, зависит от хемиосмотического процесса. Механизм этого процесса, впервые предложенный в 1961 г., позволил разрешить проблему, давно стоявшую перед биологией клетки. Однако идея была настолько нова, что лишь через несколько лет она получила всеобщее признание в результате
Рис. 7-15. Основной итог превращения энергии, происходящего в митохондрии. В этом процессе, называемом окислительным фосфорилированием, внутренняя митохондриальная мембрана играет роль энергопреобразующего устройства, которое превращает часть энергии окисления NADH (и FADH2) в энергию фосфатных связей АТР.
439
Таблица 7-1. Хемиосмотическое сопряжение
Хемиосмотическая гипотеза, предложенная в начале 60-х годов, включала четыре независимых постулата, касавшиеся функции митохондрий:
1.Митохондриальная дыхательная цепь, находящаяся во внутренней мембране, способна перемещать протоны; при прохождении электронов по дыхательной цепи происходит «откачивание» Н+ из матрикса.
2.Митохондриальный АТР-синтетазный комплекс тоже перемещает протоны через внутреннюю мембрану. Поскольку этот процесс обратим, фермент может не только использовать энергию гидролиза АТР для переноса Н + через мембрану, но при достаточно большом протонном градиенте протоны начинают «течь» через АТР-синтетазу в обратном направлении, что сопровождается синтезом АТР.
3.Внутренняя мембрана митохондрий непроницаема для Н + , ОН" и вообще всех анионов и катионов.
4.Внутренняя митохондриальная мембрана содержит ряд белков-переносчиков, осуществляющих транспорт необходимых метаболитов и неорганических ионов.
накопления экспериментальных данных. Раньше думали, что энергию для синтеза АТР в дыхательной цепи обеспечивает такой же механизм, как и при субстратном фосфорилировании: предполагалось, что энергия окисления используется для образования высокоэнергетической связи между фосфатной группой и каким-то промежуточным соединением и что превращение ADP в АТР осуществляется за счет энергии, выделяемой при разрыве этой связи. Однако, несмотря на интенсивные поиски, предполагаемый интермедиат не был обнаружен.
Согласно хемиосмотической гипотезе, вместо богатых энергией промежуточных продуктов существует прямая связь между процессами химическими («хеми...») и транспортными (осмотическими, от греческого osmos - толчок, давление) - хемиосмотическое сопряжение (табл. 7-1). При прохождении высокоэнергетических электронов, доставляемых NADH и FADH2, по дыхательной цепи внутренней митохондриальной
Рис. 7-16. Потоки важнейших метаболитов, поступающих в митохондрию и выходящих из нее. Пируват и жирные кислоты входят в митохондрию и метаболизируются в цикле лимонной кислоты, в котором образуется NADH. Затем в ходе окислительного фосфорилирования богатые энергией электроны NADH передаются на кислород с помощью дыхательной цепи, находящейся во внутренней мембране; при этом благодаря хемиосмотическому механизму образуется АТР.
NADH, образовавшийся в цитозоле при гликолизе, тоже передает свои электроны в дыхательную цепь (не показано). Так как NADH не способен проходить через внутреннюю мембрану, перенос его электронов осуществляется непрямым путем -при помощи одной из нескольких челночных систем, транспортирующих в митохондрию другое восстановленное соединение; после окисления это соединение возвращается в цитозоль, где вновь восстанавливается с помощью NADH.
440
мембраны от одного переносчика к следующему высвобождается энергия, которая используется для перекачивания протонов (Н+ ) через внутреннюю мембрану из матрикса в межмембранное пространство. В результате на внутренней мембране создается электрохимический протонный градиент; энергию обратного тока протонов «вниз» по этому градиенту использует связанный с мембраной фермент АТР-синтетаза, катализирующий образование АТР из ADP и Рi, т. е. завершающий этап окислительного фосфорилирования (рис. 7-16).
В оставшейся части этого раздела мы кратко рассмотрим тот тип реакций, который делает возможным окислительное фосфорилирование; детали будут обсуждаться позже (разд. 7.2).
7.1.6. Электроны переносятся с NADH на кислород с помощью трех больших ферментных комплексов дыхательной цепи [7]
Хотя механизмы извлечения энергии в дыхательной цепи и в других катаболических реакциях различны, в их основе лежат общие принципы. Реакция Н2 + 1/2 О2 → Н2О разбита на много небольших «шагов», так что высвобождаемая энергия может переходить в связанные формы, а не рассеивается в виде тепла. Как и в случае образования АТР и NADH при гликолизе или в цикле лимонной кислоты, это связано с использованием непрямого пути. Но уникальность дыхательной цепи заключается в том, что здесь прежде всего атомы водорода расщепляются на электроны и протоны. Электроны передаются через серию переносчиков, встроенных во внутреннюю митохондриальную мембрану. Когда электроны достигают конца этой электронтранспортной цепи, протоны оказываются там же для нейтрализации отрицательного заряда, возникающего при переходе электронов на молекулу кислорода (рис. 7-17).
Проследим процесс окисления, начиная с образования NADH - главного акцептора реактивных электронов, извлекаемых при окислении молекул питательных веществ. Каждый атом водорода
Рис. 7-17. Эти схемы показывают, каким образом большая часть энергии «сжигания» водорода не рассеивается в виде тепла (слева), а улавливается
изапасается в полезной для клетки форме с помощью электронтранспортной цепи, находящейся во внутренней митохондриальной мембране (справа). Остаток энергии высвобождается митохондрией в форме тепла. В действительности изображенные здесь электроны и протоны отнимаются от атомов водорода, ковалентно связанных с молекулами NADH или FADH2 (см. рис. 7-18).