Лысак Микробиология

ны. Многие из них вызывают порчу пищевых продуктов при низких температурах. Оптимум для роста факультативных психрофилов соответствует 25–30 ºС, т.е. они способны расти в условиях, благоприятных для мезофильных организмов. К этой группе относятся некото-

рые виды бактерий родов Pseudomonas, Arthrobacter и др.

Способность психрофилов развиваться при низкой температуре связывают с особенностями строения их клеток:

-температурный оптимум активности ферментов у них ниже, чем

уаналогичных ферментов мезофильных микроорганизмов. При отклонении температуры от оптимальной активность большинства ферментов психрофилов значительно быстрее падает при повышении температуры, чем при ее понижении. Тем не менее некоторые ферменты психрофилов при повышении температуры усиливают свою активность. Это ферменты, вызывающие деградацию или разрушение клеточных макромолекул. Это может быть одной из причин термочувствительности облигатных психрофилов;

-проницаемость их мембран остается высокой при охлаждении благодаря содержанию в липидах ненасыщенных жирных кислот, вследствие чего мембраны не застывают и остаются полужидкими;

-белоксинтезирующий аппарат психрофилов способен функционировать при низких температурах.

К термофильным относят микроорганизмы, которые растут при температуре выше 45–50 ºС. Группу термофилов делят на 4 подгруппы:

1) термотолерантные – растут в пределах от 10 до 55–60 ºС, оптимальная область лежит при 35–40 ºС (как у мезофилов). Основное их отличие от мезофилов – способность расти при повышенных температурах. Примером термотолерантных бактерий являются бактерии вида Methylococcus capsulatus.

2) факультативные термофилы имеют температурный макси-

мум 50–65 ºС и минимум менее 20 ºС, оптимум приходится на область температур близких к верхней границе роста. Примером факультативных термофилов являются гомоферментативные молочнокислые бактерии рода Lactobacillus. Они обитают на поверхности многих растений, откуда они попадают в различные продукты – их легко обнаружить в молочных продуктах, солениях, маринадах, вине, фруктовых соках. Лактобациллы постоянно присутствуют в ротовой полости, кишечном тракте многих теплокровных животных и человека;

3) облигатные термофилы способны расти при температурах до 70 ºС и не растут при температуре ниже 40 ºС. Оптимальная темпера-

90

турная область облигатных термофилов примыкает к их верхней температурной границе роста (65–70 ºС). Представители облигатных тер-

мофилов – бактерии вида Bacillus stearothermophilus и др.;

4) экстремальные термофилы имеют следующие температурные параметры: оптимум в области 70–75 ºС, минимальная граница роста

– 40 ºС и выше, максимальная – около 90 ºС. Эти микроорганизмы распространены в горячих источниках, особенно в районах активной вулканической деятельности. Представители – бактерии родов Thermus, Thermomicrobium, Thermoplasma и др.

Природу термоустойчивости у бактерий объясняют рядом структурных и биохимических особенностей этих бактерий:

-липиды, входящие в состав клеточных мембран, содержат насыщенные жирные кислоты. В связи с этим они имеют более высокую точку плавления по сравнению с липидами, содержащими ненасыщенные жирные кислоты;

-у экстремально термофильных бактерий обнаружено повышенное содержание гуанина и цитозина в ДНК, что придает стабильность и повышает точку плавления этих молекул;

-ферменты термофилов гораздо устойчивее к нагреванию в сравнении с соответствующими белками мезофильных бактерий. Часто такая высокая термостабильность достигается в результате изменения первичной структуры белковой молекулы. В качестве примера можно привести следующий – при сравнении лактатдегидрогеназ мезофильных и термофильных бактерий рода Bacillus обнаружено увеличенное содержание основных аминокислот аргинина и лизина в активном

центре лактатдегидрогеназ у термофилов. Устойчивость ферментов термофилов обеспечивается также ионами Са2+, кофакторами и другими агентами, которые связываются с ними.

Термофильные бактерии имеют большое практическое значение. Обладая очень интенсивным метаболизмом, они являются активными продуцентами витаминов, ферментов, органических кислот, кормового белка и других ценных веществ. Это широко используется в микробиологической промышленности, так как применение мезофильных микроорганизмов в ней ограничено из-за того, что в результате культивирования часть энергии выделяется в тепло и происходит разогрев субстрата (питательной среды), что приводит к гибели мезофильных микроорганизмов.

Термофильные бактерии играют также большую роль в биологической очистке бытовых отходов и образовании метана.

91

Микроорганизмы подвержены воздействию различных видов электромагнитных излучений. Эффект воздействия зависит от дозы облучения и длины волны. Наиболее длинноволновая радиация (радиоволны – длина волны более 1100 нм) не вызывает биологического эффекта. Инфракрасные лучи (700–1100 нм и более) проявляют тепловое действие на микроорганизмы и используются зелеными и пурпурными бактериями в процессе фотосинтеза. Видимая часть спектра (300–700 нм) используются цианобактериями и другими фототрофными бактериями в процессе фотосинтеза. УФ-лучи (10–300 нм) могут оказывать на микроорганизмы как микробоцидное, так и мутагенное действие, что определяется видом микроорганизмов и дозой облучения. Наибольший летальный эффект УФ-лучей наблюдается при длине волны 260 нм, при которой отмечается максимум поглощения УФ-лучей молекулами ДНК. Летальное действие УФ-лучей объясняется в первую очередь изменениями структуры ДНК: разрывом водородных связей, расщеплением связей между дезоксирибозой и фосфатом, а также образованием сшивок между тиминовыми азотистыми основаниями (димеров тимина), которые обусловливают нарушение процессов репликации и транскрипции.

Облучение УФ-лучами не всегда приводит клетку бактерий к гибели. Многие микроорганизмы обладают механизмами, призванными исправлять (репарировать) повреждения ДНК, вызванные УФоблучением. Гибель клеток от облучения УФ-светом наступает тогда, когда повреждение происходит быстрее, чем репарация ДНК. Кроме нуклеиновых кислот, УФ-лучи поглощают белки и другие макромолекулы, что приводит к нарушению их структуры и функций.

Квоздействию УФ-излучения более устойчивы те виды бактерий,

вклетках которых содержатся каротиноиды. У гетеротрофных организмов каротиноиды служат защитной системой, снижающей повреждения нуклеиновых кислот, а у фототрофных бактерий они предохраняют бактериохлорофилл от фотоокисления.

Ионизирующая радиация, под которой обычно подразумевают рентгеновское и гамма-излучение (с длиной волны менее 10 нм), вызывает летальный для клетки эффект. Она, в отличие от УФ-лучей, действует на биополимеры не прямо, а опосредованно, вызывая образование свободных радикалов и органических перекисей, которые реагируют с нуклеиновыми кислотами и белками, вызывая одно- и двунитевые разрывы цепей ДНК, изменения азотистых оснований, окисление сульфгидрильных групп белков в дисульфидные и т.д. Чувствительность микроорганизмов различных групп к ионизирующей

92

радиации проявляется в разной степени. Например, бактерии Clostridium botulinum (тип Е) сохраняют жизнеспособность при дозе 1,5 Мрад, Escherichia coli – только 0,18 Мрад. Абсолютным «чемпионом» по устойчивости к ионизирующей радиации являются бактерии Micrococcus radiodurans, которые обитают в водах атомных реакторов, встречаются в залежах урановых руд. Эти бактерии устойчивы к дозе ионизирующего излучения в 2–3 Мрад, что объясняется наличием в их клетках мощных репарационных систем, призванных исправлять повреждения в ДНК. Ионизирующее излучение используется в качестве стерилизующего фактора, в том числе, для продления срока хранения некоторых продуктов (фруктов, овощей, морепродуктов).

Высокие значения гидростатического давления приводят к разрушению клеточных структур, происходит денатурация белков, прекращается деление и клетки приобретают нитевидную форму. Однако существуют бактерии, которые живут на глубине 7000 м и более, где давление достигает более 1000 атмосфер. Из осадков на дне океанов выделяют бактерии двух групп: баротолерантные и пьезофильные

(барофильные). Баротолерантные бактерии размножаются как при обычном, так и при давлении в несколько сот атмосфер. Барофильные (менее многочисленная группа) при давлении в сотни атмосфер дают больший урожай биомассы, чем при атмосферном давлении. Пьезофильные бактерии (например, бактерии вида Bacillus submarinus) – это обитатели глубоководных впадин морей и океанов.

Концентрация веществ, растворенных в окружающей среде, т.е. осмотическое давление, также оказывает большое влияние на жизнеспособность микроорганизмов: чем концентрированнее раствор, тем труднее клетке поглощать из него воду. В гипертонических растворах, т.е. таких, в которых осмотическое давление больше, чем в клетке, происходит обезвоживание клеток (плазмолиз) и полное прекращение роста. Это явление называется физиологической сухостью. Однако некоторые микроорганизмы способны нормально развиваться в достаточно концентрированных растворах. Такие микроорганизмы называют осмофильными. Осмофильные микроорганизмы, для которых требуется высокое содержание NaCl, получили название галофильных. К экстремальным галофилам относятся бактерии из родов Halobacterium и Halococcus, живущие в растворах NaCl при концентрациях, близких к насыщающим. У таких бактерий концентрация солей в цитоплазме равна концентрации внешнего раствора, однако в клетках преобладает не натрий, а калий. Белки галофильных бактерий отличаются по строению от таковых негалофильных: содержание кислот-

93

ных групп в них преобладает над основными. Эти кислотные группировки нейтрализуются катионами. Высокие концентрации солей необходимы галофилам для поддержания каталитической активности ферментов, стабилизации мембран и рибосом. Галофильные бактерии обнаружены в соленых озерах, в солончаковых почвах. Они обычно вызывают порчу соленой рыбы и мяса.

Высокочастотные (> 16 кГц) механические колебания упругой среды или ультразвук не воспринимаются нашими органами слуха. При воздействии на микроорганизмы ультразвук создает большую разницу в давлении на отдельные части клеток и повреждает их: разжижается и вспенивается цитоплазма, разрушаются поверхностные структуры, содержимое клетки смешивается с окружающей средой. Чувствительность микроорганизмов к ультразвуку, пропорциональная частоте колебаний и длительности воздействия, зависит также и от их индивидуальных особенностей и физиологического состояния. Чем крупнее клетки, тем более чувствительны они к воздействию ультразвука; палочки и извитые формы более чувствительны, чем кокки. При длительном воздействии наблюдается полная гибель микроорганизмов, что используется в целях стерилизации. Ультразвук применяют и для разрушения клеток с целью извлечения из них некоторых биологически активных веществ.

Кроме охарактеризованных физических факторов на развитие микроорганизмов оказывает воздействие изменение напряжения магнитных полей. Этот фактор в настоящее время рассматривается, как экологический, определяющий протекание многих биологических процессов. Особенно чувствительны к изменению напряжения магнитного поля магниточувствительные микроорганизмы, содержащие в клетках магнитосомы.

Небезразличны микроорганизмы также к действию земного притяжения, сотрясений, а также электрического тока.

4.3. Антимикробное действие антибиотиков

Антибиотики (антибиотические вещества) – низкомолекулярные продукты метаболизма микроорганизмов, растений и животных или их модификации, задерживающие рост или полностью подавляющие развитие других микроорганизмов. Большинство известных в настоящее время антибиотиков образуются именно клетками микроорганизмов.

Первый антибиотик был открыт шотландским бактериологом А.Флемингом в 1929 году. Флеминг А. выделил плесневый гриб, ко-

94

торый был определен как Penicillium notatum, и установил, что культуральная жидкость этой плесени способна оказывать антибактериальное действие по отношению к патогенным коккам. Культуральная жидкость гриба, содержащая антибактериальное вещество, названа А.Флемингом пенициллином. Хотя попытки А.Флеминга выделить активное начало, образуемое грибом P.notatum не увенчались успехом, но большой его заслугой является то, что он указал на перспективы практического применения обнаруженного им агента.

Спустя примерно десять лет после сообщения А.Флеминга пенициллин начал изучать Э.Чейн. Он был убежден, что это вещество – фермент. В 1940 году Х.Флори и Э.Чейн получили в кристаллическом виде пенициллин и установили, что это не фермент, а низкомолекулярное вещество пептидной природы.

Изучение пенициллина в бывшем Советском Союзе было начато З.В.Ермольевой. В 1942 году под ее руководством в лаборатории биохимии микробов Всесоюзного института экспериментальной медицины в Москве был получен первый отечественный антибиотик, сходный с пенициллином, – крустозин, сыгравший огромную роль в спасении жизней воинов в годы Великой Отечественной войны.

После того как было установлено, что пенициллин обладает активностью в отношении возбудителей септических инфекций, пневмонии, эпидемического менингита и других заболеваний, начались интенсивные поиски продуцентов этого антибиотика. В результате было установлено, что пенициллин могут синтезировать не только Penicillium notatum, но и многие другие виды грибов, например,

P.chrysogenum, P.nigricans, Aspergillus flavus, A.nidulans.

Пенициллины, синтезируемые различными микроорганизмами, близки по химическому строению. Они относятся к группе β- лактамных антибиотиков, общим для которых является наличие 4-х членного β-лактамного кольца, входящего в состав 6-аминопени- циллановой кислоты. К 6-аминопенициллановой кислоте присоединен радикал. В зависимости от того, какой радикал присоединен к 6-аминопенициллановой кислоте, все антибиотики пенициллинового ряда разделяют на природные и полусинтетические. В качестве примера рассмотрим строение бензилпенициллина или пенициллина G:

95

β-лактамное кольцо

Исходным продуктом для получения полусинтетических пенициллинов является 6-аминопенициллановая кислота, которую чаще всего получают путем расщепления природных пенициллинов ферментом пенициллинацилазой, синтезируемым многими микроорганизмами:

пенициллинацилаза

Затем к 6-аминопенициллановой кислоте химическим путем присоединяют различные радикалы. Примером полусинтетических антибиотиков пенициллинового ряда являются:

- ампициллин:

NH2

COOH

96

дальше отстоят друг от друга организмы в таксономическом отношении, тем меньше вероятность, что они синтезируют один и тот же тип антибиотика.

Антибиотики в химическом отношении представляют очень гетерогенную группу соединений:

- молекулярная масса антибиотиков варьирует от 150 до 5000 дальтон, т.е. это низкомолекулярные вещества;

- молекулы одних антибиотиков состоят или только из атомов С и Н, но чаще из С, О, Н и N; другие антибиотики содержат также атомы серы, фосфора и галогенов;

-в молекулах антибиотиков представлены почти все функциональные группы, известные в органической химии (гидроксильная, карбоксильная, карбонильная, азотсодержащие функциональные группы

ит.д.), а также алифатические и алициклические цепи, ароматические кольца и т.д.

Общим для всех антибиотиков является то, что они могут быть получены в кристаллическом виде.

Отличие антибиотиков от других продуктов метаболизма микроорганизмов, также подавляющих рост отдельных видов, как, например, спирты, органические кислоты, перекиси состоит в следующем:

-во-первых, антибиотики обладают высокой биологической активностью. Например, для подавления роста грамположительных бактерий (стрептококков, микрококков и др.) требуется концентрация антибиотика эритромицина, равная всего 0,01 – 0,25 мкг/мл. Конечно, при таких ничтожно малых концентрациях спирта или органической кислоты никакого ингибирующего бактерии эффекта быть не может;

-во-вторых, антибиотики обладают избирательностью биологического действия. Это означает, что не все микроорганизмы чувствительны к конкретному антибиотику. В этой связи микроорганизмы делят на две группы: чувствительные к определенным антибиотикам и резистентные, или устойчивые, к ним.

Антибиотики часто объединяют в группы в зависимости от того, рост каких микроорганизмов они подавляют. Выделяют следующие группы антибиотиков: противовирусные, антибактериальные, противогрибковые, антипротозойные, противоопухолевые.

Чувствительность различных бактерий к антибиотикам определяется в значительной мере структурой клеточной стенки, поскольку от этого зависит способность антибиотика проникать в бактериальную клетку. В соответствии с активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий антибактериальные антибиотики

98

можно разделить на две группы. Большинство антибиотиков действуют на грамположительные бактерии, через клеточную стенку которых эти соединения легче проникают, так как в ней нет дополнительного барьера наружной мембраны. Такие антибиотики относят к соединениям с узким спектром действия. Антибиотики, активные в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, называются антибиотиками широкого спектра действия.

Бактерицидный или бактериостатический эффект, вызываемый антибиотиками, как правило, связан с нарушением отдельных звеньев метаболизма или структур бактериальных клеток.

В зависимости от механизма действия антибиотики делят на несколько групп:

-ингибирующие синтез клеточной стенки (пенициллины, бацитрацин, ванкомицин, цефалоспорины и др.);

-нарушающие функционирование цитоплазматической мембраны (грамицидины, валиномицин, полиены, трихомицин и др.);

-подавляющие синтез РНК (рифампицины, стрептоварицины и

др.);

-подавляющие синтез ДНК (митомицин С, противоопухолевые, новобиоцин и др.);

-ингибирующие синтез белка (хлорамфеникол, стрептомицин, канамицин, эритромицин, линкомицин, пуромицин, фузидиевая кислота, тетрациклины и др.).

Рассмотрим механизм действия некоторых антибиотиков. Пенициллин ингибирует синтез пептидогликана муреина, входя-

щего в состав клеточной стенки. В частности он нарушает образование пептидных связей в процессе синтеза пептидогликана, инактивируя ключевой фермент транспептидазу, ответственный за этот процесс. Синтезируется несшитый пептидогликан, в результате чего образуется «ослабленная» клеточная стенка, неспособная выдержать увеличивающееся в результате роста клетки, давление, что приводит к разрушению и лизису клеток.

Митомицин С блокирует синтез ДНК за счет того, что его молекулы связываются с ДНК в области репликативной вилки, образуя поперечные сшивки между цепями и препятствуя их разделению. ДНКполимераза не может продвигаться по ДНК и осуществлять репликацию.

Актиномицин Д связывается с ГЦ-богатыми участками в молекуле ДНК и препятствует перемещению ДНК-зависимой РНК-поли- меразы вдоль ДНК-матрицы из-за невозможности локального распле-

99