Глава 2. Способы получения

Существует несколько способов получения И.ф.:

а) путем образования ковалентных связей между ферментом и матрицей;

б) полимеризацией мономера, образующего матрицу в присутствии фермента, который при этом оказывается включенным в сетку полимера (обычно геля);

в) благодаря электростатическому взаимодействию противоположно заряженных групп фермента и матрицы;

г) сополимеризацией фермента и мономера, образующего матрицу;

д) связыванием фермента и матрицы в результате невалентных взаимодействий (напр., гидрофобных, с образованием водородных связей);

ж) инкапсулированием ферментов, т. е. созданием около молекул фермента полупроницаемой капсулы, напр. включением фермента в липосомы;

з) сшиванием молекул фермента между собой, напр. глутаровым альдегидом.

Наибольшее распространение получили ковалентное связывание фермента с матрицей и включение фермента в гель. Для иммобилизации наиболее широко используются природные полисахариды и синтетические носители полиметильного типа, сефадексы, агар. Важным преимуществом И.ф. является возможность их многократного использования (в отличие от нативных ферментов в растворе). И.ф. нашли широкое применение в пищевой и фармацевтической промышленности: в производстве L-аминокислот, глюкозо-фруктовых сиропов, глюкозы, 6-аминопенициллановой кислоты, из которой получают полусинтетические пенициллины, в синтезе преднизолона, для удаления лактозы из продуктов питания, используемых больными с лактазной недостаточностью, в изготовлении ферментных электродов для экспресс-определения мочевины, глюкозы и др.

Глава 3. Применение

Преимущество иммобилизованных ферментов позволило создать новые промышленные технологические процессы. Ниже указано применение их в лёгкой и химической промышленности, производстве пищевых продуктов и лекарственных препаратов.

Широкое применение иммобилизованных ферментов следует отметить в области химической промышленности: 1. Добавление ферментов в стиральные порошки позволяет удалять застарелые, а также масляные и жировые пятна. 2. С помощью иммобилизованных ферментов со шкур удаляют волосяной покров и смягчают кожу после дубления. 3. Из обрезков шкур с помощью иммобилизованных ферментов извлекают шерсть, которая используется для производства тканей. 4. Иммобилизованные ферменты участвуют в получении из перекиси водорода кислорода, который необходим для превращения латекса в губчатую резину.

В пищевой промышленности следует отметить процессы:

1. Осветления фруктовых соков с помощью иммобилизованных ферментов. 2. В результате ферментативного гидролиза целлюлозы получается глюкоза, которая используется в пищу человека и добавляется в корм животным. 3. Получение глюкозофруктозных сиропов. Фруктоза (фруктовый или медовый сахар) – важнейший в физиологическом и технологическом отношении природный моносахарид. Превращаясь в печени и кишечнике животных в глюкозу, фруктоза включается в пластический и энергетический обмен клетки. Она в 2,5 раза слаще глюкозы и в 1,7 раза слаще тростникового сахара (сахароза), благодаря чему фруктоза менее калорийный пищевой продукт по сравнению с последним. 4. В отличие от глюкозы обмен фруктозы не контролируется инсулином, поэтому фруктовый сахар может потребляться больными диабетом. 5. Фруктоза не вызывает кариеса зубов. 6. В смеси с глюкозой фруктоза не кристаллизуется, поэтому широко используется для производства кондитерских изделий.

Ферменты в пищевой (молочной) промышленности. 

У каждого народа имеется хотя бы одно национальное блюдо, приготовленное путём брожения. В Армении и Грузии широко применяют мацони, в Болгарии и Беларуси популярен кефир, во Франции и Испании – сыры типа Рокфор, русская и украинская кухня немыслимы без ржаного хлеба и простокваши. Из национальных блюд эти продукты превратились в общепризнанные, интернациональные. Ещё И. И. Мечников в конце 19 века обратил внимание на важность нормальной деятельности кишечной микрофлоры и в случае нарушения – необходимость её восстановления с помощью молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus, предотвращающих развитие чужеродных микробов. Чистые культуры этих бактерий используют для получения ацидофилина. Его изготовляют из стерильного молока (стерилизация 15 мин при 120°С или 30 мин при 110°С), добавляя чистую посевную культуру и выдерживая 20-48 часов при температуре 35-37°С до получения продукта требуемой кислотности. Количество живых бактерий Lactobacillus acidophilus в ацидофилине должно быть не менее 200 млн. в 1 мл. Содержание молочной кислоты в хорошо приготовленном ацидофилине 0,65-0,75%. Во время брожения ацидофильные бактерии синтезируют органические кислоты (в основном молочную), ассимилируя глюкозу, галактозу, лактозу и другие сахара. Популярным молочнокислым продуктом можно считать кефир. В глубокой древности для приготовления кефира кобылье, козье, овечье или коровье молоко засевали так называемыми «кефирными зёрнами». Это была естественная симбиотическая микрофлора, включающая молочнокислые бактерии Lactobacillus casei, дрожжи Saccharomyces kefir и некоторые виды сопутствующих стрептококков. Молоко сбраживалось в курдюках; в результате выделения диоксида углерода напиток становился шипучим. Современный кефир в основном готовят путём заквашивания коровьего молока.

Микрофлора другого молочнокислого продукта – йогурта – смешанная, но доминирует болгарская палочка Lactobacillus bulgaricus, сбраживающая глюкозу, галактозу и лактозу. Кумыс получают из кобыльего молока с помощью молочно – кислых бактерий (Lactobacillus casei), стрептококков и дрожжей, сбраживающих лактозу.

Приготовление сыра. Сыр готовят из творога, полученного в результате свёртывания казеина цельного или обезжиренного молока. Свёртывание казеина происходит под влиянием микробных ферментов и молочной кислоты или при помощи сычужного фермента. В свёртывании принимают участие молочнокислые бактерии Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus diacetilactis. В результате свёртывания белка кальций отделяется от казеина, последний выпадает в осадок в виде хлопьев водонерастворимой казеиновой кислоты. Для изготовления различных видов сыра используют овечье, козье, коровье или кобылье молоко. В зависимости от технологии сыроварения сыворотку полностью или частично отделяют от творога на фильтр-прессе. Творог засевают культурами микроорганизмов в соответствии с сортом получаемого сыра. При его созревании под влиянием выделяемых микроорганизмами ферментов химический состав и физические свойства творога существенно меняются. Острый привкус сыра Рокфор обусловлен действием микробной липазы – фермента, расщепляющего жиры молока с образованием жирных кислот (капроновой, каприловой, каприновой). Созревание сыра длится от нескольких недель до нескольких месяцев (для сыра Чеддер – 8 мес.). В первые недели созревания число микроорганизмов в массе сыра увеличивается и достигает нескольких сотен миллионов в 1 г массы сыра, потом число живых бактерий и дрожжей снижается. Сыр должен созревать при пониженной температуре (для сыра Рокфор - не выше 9°С). В молочной промышленности широко используют ферменты в целях повышения качества продукции и расширения ассортимента. Для коагуляции белков при изготовлении сыра применяют сычужный фермент реннин (гемозин), получаемый из желудка (сычуга) молодых телят. В настоящее время более 500 сортов сыра изготовляют с применением реннина (гемозиновые сорта). Он является эффективным сгустителем казеина и расщепляет минимальное количество молочных белков до водорастворимых компонентов. Чтобы удовлетворить спрос на реннин, разработано несколько способов получения аналогичного фермента микробного происхождения. Ещё в 20-е годы было предложено использовать в сыроварении протеазы плесневого гриба рода Mucor, однако предложенные грибы оказались непригодными, главным образом из-за синтеза неприемлемых побочных продуктов. В 80-е годы было выделено два термофильных штамма мукоральных грибов Mucor pusilus и Mucor miehei, синтезирующих подходящие ферменты, хотя оказалось, что микробный ренин имеет более высокую по сравнению с животным протеолитическую активность. Хорошими сгустителями являются также протеазы других микроорганизмов (Pseudomonas mixoides, Bacillus licheniformis). В настоящее время в сыроварении используют около 10% реннина микробного происхождения. Получены результаты по успешной трансплантации в клетки бактерий гена, отвечающего за синтез ренина в организме животных, что существенно увеличивает возможности использования микробного реннина. В молочной промышленности применяют каталазу, использование которой совместно с пероксидом водорода позволяет исключить процесс пастеризации, проводимой с целью инактивации патогенной и посторонней микрофлоры. В результате пастеризации теряются естественные ферменты молока. Пероксид водорода в концентрации 0,2-0,3% от объёма молока выполняет функции дезинфектора, существенно не влияя на ферменты молока (липазу, протеазу, фосфатазу). Добавки каталазы инактивируют остатки пероксида водорода в молоке. При производстве 1 тонны сыра образуется 9 тонн сыворотки и пахты. В каждой тонне сыворотки содержится около 5 кг высококачественного белка, витамины группы В, комплекс свободных аминокислот, все важнейшие минеральные элементы, в том числе фосфор и кальций. Но главной ценностью сыворотки является лактоза (молочный сахар). В 1 тонне сыворотки содержится около 50 кг молочного сахара – ценнейшего сырья для пищевой и микробиологической промышленности. Лактоза имеет низкую сладость, но при действии на неё лактазы расщепляется на два моносахарида – глюкозу и галактозу. Разработано несколько биотехнологических приёмов для рационального использования сыворотки и пахты: На вторичном молочном сырье можно выращивать культуры кормовых дрожжей, обладающих лактозной активностью (Saccharomyces fragilis, Zygosaccharomyces lactis). Из этих дрожжей можно выделить лактозу. Весьма эффективным является выделение из депротеинизированной сыворотки сахаров путём биогидролиза молочного сахара с помощью иммобилизованной лактазы. Степень конверсии молочного сахара составляет 80%. Продукты гидролиза (глюкоза и гагактоза) успешно применяют в разных отраслях пищевой промышленности, например для приготовления мороженного. Добавление этих сахаров в мороженное препятствует кристаллизации сахаров, и его можно сохранять длительное время (до 4 мес.).

Практическое применение ферментов (энзимов) в животноводстве. Ферменты - это природные вещества, способные ускорять обменные процессы в организме животных, птиц, свиней, молодняка крупного рогатого скота. Прежде всего, их применение значительно удешевляют корма (до 10%) и улучшают их усвоение в организме. Применение ферментов в кормлении бройлеров, поросят и свиней увеличивает среднесуточный прирост живой массы на 4-5%, яйценоскость кур-несушек в среднем на 5% при снижении расхода кормов от 5 до 10%. Применение ферментных препаратов при силосовании позволяет реализовывать процесс силосования в направлении частичного расщепления целлюлозы, гемицеллюлозы, пектиновых веществ и протеинов до пептидов и аминокислот и тем самым значительно повысить питательность корма. Необходимость гранулирования и микрокапсулирования ферментных препаратов продиктована в значительной степени требованиями по охране труда на биотехнологических предприятиях. Вместе с тем производители, выпускающие гранулированные и микрокапсулированные препараты, утверждают, что такие формы препаратов хорошо сыпучие, более стабильные и безопасные для человека в процессе их ввода в комбикорма. Производители, выпускающие мелкодисперсные кормовые дисперсные кормовые ферментные препараты (а их большинство), отмечают, что, в отличие от гранулированных и микрокапсулированных препаратов, мелкодисперсные препараты более равномерно распределяются в массе комбикорма, имеют более высокую удельную поверхность контакта с частичками комбикорма. Сухие кормовые ферментные препараты в отличие от жидких концентрированных форм можно вводить в сухие премиксы, белково-витаминно-минеральные добавки и в случае их термоустойчивости – в рассыпные комбикорма перед их гранулированием. Общепринято, что наиболее предпочтительным видом зерна в зерновой части комбикорма для птицы и свиней является кукуруза, но она дороже, поэтому зерновая часть комбикормов формируется из таких традиционных зерновых культур, как пшеница, ячмень, овёс, тритикале, рожь. Главный недостаток перечисленных зерновых культур состоит в том, что они всегда содержат антипитательные растворимые некрахмалистые полисахариды (НПС), такие как β-глюкан и арабоксилан. Наряду с этим в ячмене, овсе высокое содержание целлюлозы, арабоксилана и β-глюкана, которые являются нежелательным балластным веществом корма. Перечисленные НПС не только не расщепляются собственными ферментами желудочно-кишечного тракта животных и птицы, но и, являясь основной составной частью клеточных стенок эндосперма и оболочек зерна, препятствуют воздействию пищеварительных ферментов на содержимое клеток (белок, крахмал) и снижают усвояемость корма. Отрицательная роль НПС, особенно растворимой их части (арабоксилана и β-глюкана), состоит в том, что они, набухая в пищеварительном тракте животных и птицы, образуют вязкие растворы в тонком отделе кишечника. При этом существенно ухудшается переваримость компонентов комбикорма и снижается сохранность животных и птицы в результате активного развития патогенных микроорганизмов. Во многих странах мира при включении в комбикорма ячменя, пшеницы, тритикале, овса и ржи широко используются ферментные кормовые препараты, применение которых позволяет нейтрализовать антипитательные НПС перечисленных видов зерновых культур. При этом успешно решается проблема замены кукурузы на перечисленные виды зерна без снижения усвояемости компонентов комбикорма и продуктивности животных и птицы. Широко используются ферментные препараты в Испании, Швеции, Норвегии, Финляндии. В Великобритании, странах традиционных производителях пшеницы – Канаде и Австралии более 90% комбикормов для цыплят-бройлеров обогащается ферментными препаратами. Состав, соотношение и количество ферментов в мультиэнзимных кормовых ферментных препаратах должны подбираться адресно. Они зависят от природы как зерновой, так и белковой части комбикормов. Так, например, овёс и ячмень содержат повышенное количество целлюлозы, а клеточные стенки эндосперма этих видов зерна состоят на 75-80% из β-глюкана и на 20-25% из арабоксиланов. Поэтому в кормовые рационы, содержащие в кормовой части преимущественно овёс и ячмень целесообразно включать кормовые ферментные препараты с высоким содержанием целлюлазы и β-глюканазы и относительно меньшим ксиланазы. В отличие от ячменя и овса, пшеница, тритикале и рожь содержат небольшие количества целлюлозы, а клеточные стенки эндосперма этих видов зерна состоят на 75-80% из арабоксилана и на 20-25% – из β-глюканов. Поэтому в кормовые рационы, содержащие в кормовой части преимущественно пшеницу, рожь и тритикале необходимо включать кормовые ферментные препараты с высоким содержанием ксиланазы, меньшим – целлюлазы и β-глюканазы.

В ряде случаев более эффективным считается применение кормовых ферментных препаратов, содержащих целлюлазу, ксиланазу и β-глюканазу в сочетании с препаратами, содержащими фитазу, α-амилазу, протеазы и пектиназы.

В последние годы особое значение придаётся применению фитазы. Этот фермент активно катализирует гидролиз фитинового комплекса и существенно увеличивает усвоение органического фосфора комбикорма. При формировании состава кормовых ферментных препаратов учитываются также вид и возраст животных и птицы. В целом положительный эффект большинства известных кормовых ферментных препаратов при вводе их в комбикорма для животных и птицы, заключается в следующем: 1. В разрушении стенок растительных клеток, благодаря чему повышается доступность содержащихся в них крахмала, протеина и жиров для воздействия ферментов пищеварительного тракта; 2. В повышении переваримости питательных веществ и улучшение их всасывания в тонком отделе кишечника; 3.Вустранении негативного эффекта антипитательных некрахмалистых полисахаридов, особенно растворимой их части; 4. В компенсации дефицита собственных пищеварительных ферментов, особенно на ранних стадиях развития животных и птицы, а также при стрессах, когда выработка собственных ферментов резко снижается; 5. В улучшении микрофлоры в тонком отделе кишечника за счёт снижения вязкости содержимого кишечника и повышения уровня моносахаридов. Перечисленные функции кормовых ферментных препаратов, сопровождаются изменением следующих производственных показателей в животноводстве и птицеводстве: 1. Кормовая ценность рационов возрастает на 5-10% за счёт более полного извлечения питательных веществ и высвобождения энергии, повышения усвояемости крахмала, белка, лизина, метионина и липидов на 6-10%; 2. Снижается расход кормов на единицу произведённой продукции на 5-14%; 3. Возрастает продуктивность животных и птицы на 5-12%; 4. Появляется возможность замены основных дорогих компонентов кормов (кукуруза и соевый шрот) более дешёвыми (пшеница, тритикале, ячмень, овёс, рожь, подсолнечный шрот (жмых) и другие дешёвые источники белка и углеводов с повышенным содержанием клетчатки, без снижения продуктивности животных и птицы; 5. Существенно снижается уровень кишечных заболеваний животных и птицы и, следовательно, потребность в лекарственных препаратах; 6. Уменьшается количество и влажность помёта, а также влажность подстилки; 7. Улучшается экологическая обстановка окружающей среды за счёт более полного усвоения азота и фосфора организмом животных и птицы и снижения, таким образом, выброса этих веществ в окружающую среду на 20-40%.

Основные требования к их использованию при кормлении животных и птицы – строгое выполнение условий, оговорённых в инструкциях. Характерным свойством значительной части известных ферментных препаратов является их узкая специфическая направленность. В этой связи эффективность использования того или иного ферментного препарата очень часто целиком зависит от состава рациона, его питательности, дозы ввода препарата и равномерности смешивания его с комбикормом. Ферменты кормового назначения получают преимущественно путём микробного синтеза с использованием грибов и бактерий.