obshaja_cytologija

клеток, способных к окислительному фосфорилированию, плазматическая мембрана выполняет роль, аналогичную внутренней мембране митохондрий эукариотических клеток.

Увеличение числа митохондрий

Так же, как и другие органеллы цитоплазмы, митохондрии могут увеличиваться в числе, что особенно заметно при делении клеток или при увеличении функциональной нагрузки клетки, более того, происходит постоянное обновление митохондрий. Так, в печени средняя продолжительность жизни митохондрий составляет около 10 дней. Поэтому закономерно возникает вопрос, каким образом происходит это увеличение числа митохондрий, за счет каких процессов и каких структур образуются новые митохондрии.

Основная масса экспериментальных данных говорит о том, что увеличение числа митохондрий происходит путем роста и деления предшествующих митохондрий. Это предположение было впервые высказано Альтманом (1893), описавшим митохондрии под термином “биобласты”. Позднее с помощью цейтраферной киносъемки удалось наблюдать прижизненно деление, фрагментацию длинных митохондрий на более короткие. Особенно отчетливо виден этот процесс при делении клеток некоторых одноклеточных водорослей и низших грибов, у которых деление митохондрий скоординировано с клеточным делением. В электронный микроскоп часто во многих клетках можно видеть деление митохондрий путем образования перетяжки (рис. 213), например в клетках печени (хотя без доказательств динамичности этого процесса такие наблюдения мало убедительны). Внешне все эти картины очень напоминают бинарный способ деления бактерий.

Реальность увеличения числа митохондрий путем деления были доказаны при изучении поведения митохондрий в живых клетках культуры ткани. Было обнаружено , что в течение клеточного цикла митохондрии могут вырастать до нескольких мкм, а затем фрагментироваться, делиться на более мелкие тельца.

321

Кроме того, митохондрии могут сливаться друг с другом. Так, в культуре клеток эндотелия сердца головастика ксенопуса наблюдали до 40 случаев слияния и деления митохондрий за 1 час. В клетках культуры почек эмбрионов наблюдали рост и ветвление митохондрий в S-периоде клеточного цикла. Однако уже в G2- периоде преобладали в числе мелкие митохондрии, образовавшиеся за счет деления при фрагментации длинных митохондрий.

Таким образом, размножение митохондрий идет по принципу: omnis mitochondrion e mitochondrion.

Интересны наблюдения за судьбой митохондрий в дрожжевых клетках. В аэробных условиях дрожжевые клетки имеют типичные митохондрии с четко выраженными кристами. При переносе клеток в анаэробные условия (например, при их пересеве или при перемещении в атмосферу азота) типичные митохондрии в их цитоплазме не обнаруживаются, и вместо них видны мелкие мембранные пузырьки. Оказалось, что в анаэробных условиях дрожжевые клетки не содержат полную дыхательную цепь (отсутствуют цитохрому b и a). При аэрации культуры наблюдается быстрая индукция биосинтеза дыхательных ферментов, резкое повышение потребления кислорода, а в цитоплазме появляются нормальные митохондрии. Эти наблюдения привели к представлению о том, что у дрожжей в анаэробных условиях в цитоплазме существуют промитохондриальные структуры с редуцированной системой окисления. Такие промитохондрии при переносе клеток в условия аэробной среды начинают перестраиваться, происходит включение в их мембраны элементов полной цепи окисления и фосфорилирования, что сопровождается изменением их морфологии. Так, из примитивных, неактивных промитохондрий путем их достройки и роста образуются обычные функционирующие митохондрии.

Вероятно, сходные процессы протекают и при делении митохондрий: происходит увеличение массы митохондриальных мембран со всеми специфическими компонентами за счет синтеза и включения в них отдельных

322

белков – ферментов и липидов, нарастание массы белков матрикса, а затем происходит деление как бы удвоившейся или многократно увеличившейся структуры.

Эти представления получают поддержку со стороны фактов, касающихся организации и состава митохондриального матрикса или митоплазмы, в которой обнаружены ДНК, разные типы РНК и рибосомы.

Авторепродукция митохондрий

Исследования последних лет привели к удивительным открытиям: двумембранные органеллы обладают полной системой авторепродукции. Эта система полная в том смысле, что в митохондриях и пластидах открыта ДНК, на которой в них синтезируются информационные, трансферные и рибосомные РНК и рибосомы, осуществляющие синтез митохондриальных и пластидных белков. Однако, как оказалось, эти системы, хотя и автономны, очень ограничены по своим возможностям.

ДНК в митохондриях представлена циклическими молекулами, не образующими связь с гистонами, в этом отношении они напоминают бактериальные хромосомы. Размер их невелик, около 7 мкм, в одну циклическую молекулу митохондрий животных входит 16-19тыс. нуклеотидных пар ДНК. У человека митохондриальная ДНК содержит 16,5 тыс. н.п., она полностью расшифрована. Найдено, что митохондральная ДНК различных объектов очень однородна, отличие их заключается лишь в величине интронов и нетранскрибируемых участков. Все митохондриальные ДНК представлены множественными копиями, собранными в группы, кластеры. Так в одной митохондрии печени крысы может содержаться от 1 до 50 циклических молекул ДНК. Общее же количество митохондриальной ДНК на клетку составляет около одного процента. Синтез митохондриальных ДНК не связан с синтезом ДНК в ядре.

Так же как и у бактерий митохондральная ДНК собрана в отдельную зону – нуклеоид, его размер составляет около 0, 4 мкм в диаметре. В длинных

323

митохондриях может быть от 1 до 10 нуклеоидов. При делении длинной митохондрии от нее отделяется участок, содержащий нуклеоид (сходство с бинарным делением бактерий). Количество ДНК в отдельных нуклеоидах митохондрий может колебаться в 10 раз в зависимости от типа клеток.

Прижизненно нуклеоиды митохондрий можно окрашиваться специальными флуорохромами. Оказалось, что в некоторых культурах в клетках от 6 до 60% митохондрий не имеют нуклеоида, что может объясняться тем, что деление этих органелл скорее связано с фрагментацией, а не с распределением нуклеоидов.

Как уже говорилось, митохондрии могут как делиться, так и сливаться друг с другом. В обычной культуре клеток человека Hela все митохондрии содержат нуклеоиды. Однако одна из мутантных линий этой культуры содержала митохондрии, в которых нуклеоиды с помощью флуорохромов не выявлялись. Но если эти мутантные клетки слить с цитопластами клеток исходного типа, то во всех митохондриях нуклеоиды были обнаружены. Это говорит о том, что при слиянии митохондрий друг с другом может происходить обмен их внутренними компонентами.

Важно подчеркнуть, что рРНК и рибосомы митохондрий резко отличны от таковых в цитоплазме. Если в цитоплазме обнаруживаются 80s рибосомы, то рибосомы митохондрий растительных клеток принадлежат к 70s рибосомам (состоят из 30s и 50s субъединиц, содержат 16s и 23s РНК, характерные для прокариотических клеток), а в митохондриях клеток животных обнаружены более мелкие рибосомы (около 50s).

Рибосомные РНК митохондрий синтезируются на митохондриальных ДНК. В митоплазме на рибосомах идет синтез белков. Он прекращается, в отличие от синтеза на цитоплазматических рибосомах, при действии антибиотика хлорамфеникола, подавляющего синтез белка у бактерий.

На митохондриальном геноме синтезируются и транспортные РНК, всего синтезируется 22 тРНК. Триплетный код митохондриальной синтетической системы отличен от такового, используемого в гиалоплазме. Несмотря на

324

наличие казалось бы всех компонентов, необходимых для синтеза белков, небольшие молекулы митохондриальной ДНК не могут кодировать все митохондриальные белки, только лишь их небольшую часть. Так ДНК размером 15 тыс.н.п. может кодировать белки с суммарным молекулярным весом около 6х105. В это же время суммарный молекулярный вес белков частицы полного дыхательного ансамбля митохондрии достигает величины около 2х106. Если учесть, что кроме белков окислительного фосфорилирования в митохондрии входят ферменты цикла трикарбоновых кислот, ферменты синтеза ДНК и РНК, ферменты активации аминокислот и другие белки, то видно, что, для того чтобы кодировать эти многочисленные белки и рРНК и тРНК, количества генетической информации в короткой молекуле митохондриальной ДНК явно не хватает. Расшифровка нуклеотидной последовательности митохондриальной ДНК человека показала, что она кодирует всего лишь 2 рибосомные РНК, 22 трансферных РНК и всего 13 различных полипептидных цепей.

В настоящее время имеются убедительные доказательства, что большая часть белков митохондрий находится под генетическим контролем со стороны клеточного ядра и синтезируется вне митохондрий. Так, в частности цитохром с, образуется в гиалоплазме, а из девяти полипептидных цепей в составе АТФсинтетазы только одна синтезируется в матриксе митохондрий животных. Митохондриальная ДНК кодирует лишь немногие митохондриальные белки, которые локализованы в мембранах и представляют собой структурные белки, ответственные за правильную интеграцию в митохондриальных мембранах отдельных функциональных компонентов.

Большинство митохондриальных белков синтезируется на рибосомах в цитозоле. Эти белки имеют специальные сигнальные последовательности, которые узнаются рецепторами на внешней мембране митохондрий. Эти белки могут встраиваться в них (см. аналогию с мембраной пероксисом), а затем перемещаться на внутреннюю мембрану. Этот перенос происходит в точках

325

контакта наружной и внутренней мембран, где такой транспорт отмечен (рис. 214). Большинство липидов митохондрий так же синтезируются в цитоплазме.

Все эти открытия, показывающие относительно независимое строение и функционирование системы белкового синтеза митохондрий, возродили гипотезу о эндосимбиотическом происхождении митохондрий, о том, что митохондрии представляют собой организмы типа бактерий, находящиеся в симбиозе с эукариотический клеткой.

Хондриом

Хондриом – это совокупность всех митохондрий в одной клетке. Оказалось, что такая совокупность может быть различной в зависимости от типа клеток. Так, во многих клетках хондриом представлен разрозненными многочисленными митохондриями, разбросанными довольно равномерно по всей цитоплазме, как, например, во многих недифференцированных клетках (рис. 215а). В других случаях отдельные митохондрии локализуются группами в местах интенсивной траты АТФ, как например, в клетках анализаторов сетчатки.

Вобоих этих случаях митохондрии функционируют поодиночке, их кооперативная работа, возможно, координируется какими-то сигналами из цитоплазмы. Однако существует и совершенно иной тип хондриома, когда вместо мелких одиночных разрозненных митохондрий в клетке располагается одна гигантская разветвленная митохондрия (рис. 215в). Такие митохондрии часто встречаются у одноклеточных зеленых водорослей (например у Chlorella).

Вэтих случаях мы видим не отдельные митохондрии, а сложную митохондриальную систему, сеть или, как ей дали название, митохондриальный ретикулум (Reticulum miyochondriale). Каков биологический смысл появления такой гигантской разветвленной митохондриальной структуры, объединенной в одно целое своими внешними и внутренними мембранами? Согласно хемоосмотической теории, возникший на поверхности внутренней мембраны электрохимический протонный градиент равномерно распределяется по поверхности внутренней мембраны митохондрий, она эквипотенциальна в

326

любой своей точке. Поэтому в любой точке поверхности внутренней мембраны такой разветвленной митохондрии может идти синтез АТФ, который будет поступать в любую точку цитоплазмы, где в этом есть необходимость. Т.е. такие разветвленные митохондрии могут представлять собой “электрический кабель”.

То, что это действительно имеет место, было доказано экспериментально. Были выбраны растущие в культуре ткани фибробласты, в цитоплазме которых имеются длинные нитчатые митохондрии, достигающие 60 мкм. В живых клетках их можно наблюдать с помощью флуорохрома этилродамина, который накапливается в матриксе только работающих, синтезирующих АТФ, митохондрий. Если снять разность потенциалов на внутренней мембране митохондрий, воздействуя на клетки динитрофенолом, то свечение этилродамина в митохондриях прекращается, параллельно падению синтеза АТФ. При этом гашение флуоресценции происходит во всех митохондрий. Это наблюдение показывает, что этилродамин, как протонный краситель, накапливается в матриксе митохондрий, только тогда, когда есть разность потенциалов на внутренней мембране митохондрий, т.е. когда происходит синтез АТФ.

Но динитрофенол, встраиваясь в мембрану, создает “пробой” на всех митохондриях данной клетки. А как “выключить” одну митохондрию? Для этого используется лазерный или ультрафиолетовый микролуч, который можно точно направить на избранную экспериментатором митохондрию (рис. 216). Делается это с помощью специальной оптической системы, которая позволяет одновременно рассматривать объект (в данном случае живые клетки с окрашенными родамином митохондриями) и навести на избранную деталь тонкий пучок лазера или ультрафиолетового света. При облучении отдельной митохондрии происходит в ней гашение флуоресценции родамина из-за того, что в результате пробоя внутренней мембраны митохондрии разность потенциалов на ней падает, и родамин как бы вытекает из матрикса митохондрии. При этом соседние митохондрии не меняют своего свечения и

327

продолжают синтез АТФ. Что же произойдет, если облучить небольшой участок разветвленной или же очень длинной митохондрии? В эксперименте одна из протяженных светящихся митохондрий фибробласта была локально поражена узким (0,5 мкм) микролучом оптического лазера. В результате этого вся длинная митохондрия потухла, в то время как соседние оставались без изменений (рис. 216б). Поражение микролучом участков свободной от митохондрии цитоплазмы не приводило к тушению митохондрий. Это говорит о том, что точечный пробой мембраны митохондрии приводит к снятию разности потенциалов не только в точке пробоя, но по всей длине митохондрии, которая представляет собой проводник с эквипотенциальной поверхностью. Следовательно, такие длинные нитчатые митохондрии фибробластов могут представлять собой электрические проводники, могущие передавать разность потенциалов на митохондриальных мембранах на большие расстояния и объединять удаленные участки цитоплазмы.

Это значит, что и в случае гигантских разветвленных митохондрий в любой ее точке может на внутренней мембране накопиться потенциал, достаточный для того, чтобы начался синтез АТФ. С этих позиций митохондриальный ретикулум представляет собой как бы электрический проводник, кабель, соединяющий отдаленные точки такой системы. Митохондриальный ретикулум может оказаться очень полезным не только для мелких подвижных клеток, таких как хлорелла, но и для более крупных, там, где требуется кооперация и синхронизация в работе многих структурных единиц таких как, например, миофибриллы в скелетных мышцах.

Как известно, скелетные мышцы состоят из массы мышечных волокон, симпластов, содержащих множество ядер. Длина таких мышечных волокон достигает 40 мкм, при толщине 0,1 мкм – это гигантская структура, содержащая великое множество миофибрилл, все из которых сокращаются одновременно, синхронно. Для такого сокращения к каждой единице сокращения, к каждому саркомеру миофибрилл, должно быть доставлено большое количество АТФ. На

328

продольных ультратонких срезах скелетных мышц в электронном микроскопе видны многочисленные округлые мелкие сечения митохондрий, располагающихся в соседстве с саркомерами (рис. 217). Если же исследовать поперечные срезы мышечных волокон на уровне z-дисков, то видно, что мышечные митохондрии представляют собой не мелкие шарики или палочки, а как бы паукообразные структуры, отростки которых могут ветвиться и простираться на большие расстояния, иногда через весь поперечник мышечного волокна. При этом разветвления митохондрий окружают каждую миофибриллу в мышечном волокне, снабжая их АТФ, необходимого для мышечного сокращения. Следовательно, в плоскости z-диска митохондрии представлены типичным митохондриальным ретикулумом – единой митохондриальной системой. Такой пласт или этаж митохондриального ретикулума повторяется дважды на каждый саркомер, а все мышечное волокно имеет тысячи поперечно расположенных “поэтажных” пластов митохондриального ретикулума. Было обнаружено, что между “этажами” вдоль миофибрилл располагаются нитчатые митохондрии, соединяющие эти митохондриальные пласты. Тем самым создается трехмерная картина митохондриального ретикулума, проходящего через весь объем мышечного волокна (рис. 218).

Здесь же было обнаружено, что как между ответвлениями митохондриального ретикулума, так и между ним и нитевидными продольными митохондриями существуют специальные межмитохондриальные соединения или контакты (ММК). Они образованы плотно прилегающими наружными митохондриальными мембранами контактирующих митохондрий, межмембранное пространство и мембраны в этой зоне имеют повышенную электронную плотность (рис. 219). Было сделано предположение, что через эти специальные образования может происходить функциональное объединение соседних митохондрий и митохондриальных ретикулумов в единую, кооперативную энергетическую систему. Все миофибриллы в мышечном волокне сокращаются синхронно по всей их длине, следовательно, и

329

поступление АТФ на любом участке этой сложной машины тоже должно происходить синхронно, а это может происходить лишь в том случае, если огромное количество разветвленных митохондрий-проводников будет связано друг с другом клеммами-контактами (ММК).

Доказать то, что ММК действительно участвуют в энергетическом объединении митохондрий друг с другом удалось на другом типе поперечноисчерченнных мышц – на кардиомиоцитах, клетках сердечных мышц.

Оказалось, что хондриом клеток сердечной мышцы не образует ветвящихся структур, а представлен множеством небольших вытянутых митохондрий, располагающихся без особого порядка между миофибриллами. Однако было найдено, что все соседние митохондрии стыкуются друг с другом с помощью митохондриальных контактов такого же типа, как в скелетной мышце, только их число очень велико: в среднем на одну митохондрию приходится 2-3 ММК, которые связывают митохондрии в единую цепь, где каждым звеном такой цепи (Streptio mitochondriale) является отдельная митохондрия (рис. 220). Такой тип хондриома также может служить целям синхронного сокращения всех саркомеров в миофибриллах кардиомиоцитов. Для такой кооперативной координации митохондрий должны служить множественные межмитохондриальные контакты (рис. 221, 222).

Для доказательства этой гипотезы были использованы кардиомиоциты эмбрионов крысы в культуре ткани. Эти клетке имеют гетерогенные по размеру и форме митохондрии, расположенные между миофибриллами (рис. 223). В электронном микроскопе было обнаружено, что между некоторыми митохондриями были видны ММК, объединяющие их в небольшие группы - кластеры. В дальнейшем были проведены эксперименты, аналогичные тем, которые были сделаны на культуре фибробластов: митохондрии живых кардиомиоцитов окрашивали этилродамином, а затем одну из митохондрий в группе облучали лазерным микропучком. Облучение одиночных митохондрий приводило к быстрому их гашению. В одних случаях погасала только

330