obshaja_cytologija

присутствующие в цитоплазме простейших, растений и животных (рис. 198). Митохондрии можно наблюдать в живых клетках, так как они обладают достаточно высокой плотностью. В живых клетках митохондрии могут двигаться, перемещаться, сливаться друг с другом. Особенно хорошо митохондрии выявляются на препаратах, окрашенных различными способами после осмиевой фиксации, которая хорошо стабилизирует липиды. Наиболее широко распространен метод окраски по Альтману, который описал эти клеточные органеллы в конце позапрошлого века, называя их “биобластами”.

Размеры митохондрий очень непостоянны у разных видов, так же как изменчива их форма (рис. 199). Все же у большинства клеток толщина этих структур относительно постоянна (около 0,5 мкм), а длина колеблется, достигая у нитчатых форм до 7-60 мкм. Надо сказать, что изучение величины митохондрий – не простое дело. В световом микроскопе на окрашенных препаратах не всегда можно проследить за реальными размерами митохондрий (рис. 200, 201а). Изучая митохондрии в электронном микроскопе на ультратонких срезах, трудно решить вопрос об истинной длине митохондрий, так как на срез попадает только незначительный объем данной митохондрии. Более того, на срезе одна извитая митохондрия может быть представлена несколькими сечениями (3-5), и только пространственная трехмерная реконструкция, построенная на изучении серийных срезов, может решить вопрос, имеем ли мы дело с 3-6 отдельными митохондриями или же с одной изогнутой или разветвленной. Выделенные митохондрии обычно повреждаются и фрагментируются, что также ограничивает использование этого метода для решения вопроса о величине и числе митохондрий.

В последнее время вопрос о величине и числе митохондрий занимает многих исследователей в связи с тем, что на ряде объектов показано, что размеры и число митохондрий, которые видны на ультратонких срезах, не соответствуют реальности. Так, в клетках дрожжей на срезах выявляется 5-7 сечений митохондрий; можно высчитать, что это число соответствует

311

нескольким десяткам митохондрий. Однако при использовании высоковольтной электронной микроскопии, позволяющей исследовать объекты толщиной до нескольких микрон, было обнаружено, что в клетках дрожжей есть всего лишь несколько (1-3) сильно разветвленных митохондрий (рис. 202). Есть данные, что число митохондрий и для других клеток нужно считать завышенным из-за сложности структуры разветвленных митохондрий. Более того, появились представления о том, что в одноклеточных организмах есть всего одна митохондрия, но сильно разветвленная. Так, у трипанозм в клетке присутствует одна гигантская митохондрия, имеющая сложную разветвленную форму.

Гигиантские одиночные митохондрии были описаны для одноклеточных зеленых водорослей (Polytomella, Engiena, Chlorella) (рис. 203). Длинные ветвящиеся митохондрии были описаны в клетках культуры ткани млекопитающих, в клетках многих растений как в нормальных, так и в анаэробных условиях. В последнее время стал широко применяться для изучения свойств митохондрий флуорохром родамин. Этот краситель обладает способностью люминисцировать в фиолетовом свете, если он связывается с мембранами активных митохондрий. При этом в люминисцентном микроскопе видна единая митохондриальнвя система – митохондриальный ретикулум (рис. 200, 201а).

Обычные же подсчеты показывают, что на печеночную клетку приходится около 200 митохондрий. Это составляет более 20% от общего объема цитоплазмы и около 30-35% от общего количества белка в клетке. Площадь поверхности всех митохондрий печеночной клетки в 4-5 раз больше поверхности ее плазматической мембраны. Больше всего митохондрий в ооцитах (около 300000) и у гигантской амебы Chaos chaos (до 500000).

Вклетках зеленых растений число митохондрий меньше, чем в клетках животных, так как часть их функций могут выполнять хлоропласты.

Вспермиях часто присутствуют гигантские митохондрии, спирально закрученные вокруг осевой части жгутика. Отсутствуют митохондрии у

312

кишечных энтамеб, живущих в условиях анаэробиоза, и у некоторых других паразитических простейших.

Локализация митохондрии в клетках может быть различной. Часто их расположение обусловлено топографией цитоплазматических структур и включений. Так, в дифференцированных клетках растений митохондрии большей частью расположены в периферических участках цитоплазмы, отодвинутых к плазматической мембране центральной вакуолью. В мало дифференцированных клетках меристемы растений митохондрии располагаются более или менее равномерно. В клетках эпителия почечных канальцев митохондрии ориентированы вдоль продольной оси клетки. Это связано с тем, что они располагаются между глубокими впячиваниями плазматической мембраны в базальной области клеток (рис. 204).

Обычно митохондрии скапливаются вблизи тех участков цитоплазмы, где возникает потребность в АТФ, образующейся в митохондриях. Так, в скелетных мышцах митохондрии находятся вблизи миофибрилл. В сперматозоидах митохондрии образуют спиральный футляр вокруг оси жгутика; вероятно, это связано с необходимостью использования АТФ для движения хвоста сперматозоида. Аналогичным образом у простейших и в других клетках, снабженных ресничками, митохондрии локализуются непосредственно под клеточной мембраной у основания ресничек, для работы которых необходим АТФ. В аксонах нервных клеток митохондрии располагаются около синапсов, где происходит процесс передачи нервного импульса. В секреторных клетках, которые синтезируют большие количества белков, митохондрии тесно связаны с зонами эргастоплазмы; вероятно, они поставляют АТФ для активации аминокислот и синтеза белка на рибосомах.

Ультраструктура митохондрий.

Митохондрии независимо от их величины или формы имеют универсальное строение, их ультраструктура однообразна. Митохондрии ограничены двумя мембранами (рис. 205). Наружняя митохондриальная

313

мембрана отделяет ее от гиалоплазмы. Обычно она имеет ровные контуры, не образует впячиваний или складок. На нее приходится около 7% от площади всех клеточных мембран. Ее толщина около 7 нм, она не бывает связана ни с какими другими мембранами цитоплазмы и замкнута сама на себя, так что представляет собой мембранный мешок. Наружнюю мембрану от внутренней отделяет межмембранное пространство шириной около 10-20 нм. Внутренняя мембрана (толщиной около 7 нм) ограничивает собственно внутреннее содержимое митохондрии, ее матрикс или митоплазму. Характерной чертой внутренней мембраны митохондрий является их способность образовывать многочисленные впячивания внутрь митохондрий. Такие впячивания чаще всего имеют вид плоских гребней, или крист (рис. 206, 207а).

Общая поверхность внутренней мембраны митохондрии в печеночной клетке составляет примерно треть поверхности всех клеточных мембран. Митохондрии клеток сердечной мышцы содержат втрое больше крист, чем печеночные митохондрии. Это может отражать различия в функциональных нагрузках митохондрий разных клеток. Расстояние между мембранами в кристе составляет около 10-20 нм. На срезах связь мембраны крист с внутренней мембраной прослеживается очень отчетливо, но мест таких мембранных переходов немного. Это объясняется тем, что связь между мембранами осуществляется через узкую шейку или стебелек.

Митохондриальные кристы, отходящие от внутренней мембраны и простирающиеся в сторону матрикса, обычно не полностью перегораживают полость митохондрии, не нарушают непрерывности заполняющего ее матрикса.

Ориентация крист по отношению к длинной оси митохондрии различна для разных клеток. Так, может быть перпендикулярная ориентация (клетки печени, почек) крист; в некоторых клетках (сердечная мышца) наблюдается продольное расположение крист. Часто кристы могут ветвиться или образовывать пальцевидные отростки, изгибаться и не иметь выраженной ориентации (рис. 208). У простейших, одноклеточных водорослей, в некоторых клетках высших

314

растений и животных выросты внутренней мембраны имеют вид трубок (трубчатые кристы).

Матрикс митохондрий имеет тонкозернистое гомогенное строение, в нем иногда выявляются тонкие собранные в клубок нити (около 2-3 нм) и гранулы около 15-20нм. Теперь стало известно, что нити матрикса митохондрий представляют собой молекулы ДНК в составе митохондриального нуклеоида, а мелкие гранулы – митохондриальные рибосомы. Кроме того, в матриксе встречаются крупные (20-40 нм) плотные гранулы, это – места отложения солей магния и кальция.

Функции митохондрий

Митохондрии осуществляют синтез АТФ, происходящий в результате процессов окисления органических субстратов и фосфорилирования АДФ. В клетках процессы окисления и выделения энергии, освобождающиеся в результате этого процесса, проходят в несколько взаимосвязанных этапов. При этом в качестве начальных субстратов используются различные углеводы, жирные кислоты, аминокислоты (рис.). Первые этапы окисления приводят кроме образования АТФ к появлению промежуточных продуктов, конечное окисление которых в митохондриях дает возможность клетке использовать этот процесс для синтеза основного количества АТФ.

Начальные этапы окисления углеводов происходят в гиалоплазме и не требуют участия кислорода. Поэтому они называются анаэробным окислением, или гликолизом. Главным субстратом окисления при анаэробном получении энергии служат гексозы и в первую очередь глюкоза; некоторые бактерии обладают свойством извлекать энергию, окисляяя пентозы, жирные кислоты или аминокислоты. В глюкозе количество потенциальной энергии, заключенной в связях между атомами С, Н и О, составляет около 680 ккал на 1 моль (т.е. на 180 г глюкозы); эта энергия освобождается при полном окислении глюкозы согласно следующей реакции:

С6Н12О6 + 6О2Þ 6Н2О + 6СО2 + 680 ккал

315

Вживой клетке это огромное количество энергии не освобождается одновременно, как при горении в пламени. Освобождение энергии идет в виде ступенчатого процесса, управляемого целым рядом окислительных ферментов,

ине связано с переходом энергии химической связи в тепло, как при горении, а с переходом ее в макроэнергетическую связь в молекуле АТФ, которая синтезируется при использовании освобождающейся энергии из АДФ и фосфата.

Впроцессе гликолиза происходит неполное окисление субстрата. В результате гликолиза глюкоза распадается до триоз, при этом тратятся 2 молекулы АТФ и синтезируются 4 молекулы АТФ. Так что в конечном результате клетка “зарабатывает” всего 2 молекулы АТФ. В энергетическом отношении этот процесс малоэффективен, поэтому из 680 ккал, заключающихся в связях 1 моля глюкозы, освобождается менее 10% энергии. Несмотря на низкий энергетический выход, анаэробное окисление, гликолиз, широко используется в живой природе. Он является основным поставляющим энергию процессом для многих микроорганизмов, некоторых кишечных паразитических анаэробных простейших, для клеток высших организмов на ранних стадиях эмбрионального развития, для многих опухолевых клеток, для клеток культуры ткани и др. Эритроциты млекопитающих, например, получают всю необходимую им энергию за счет гликолиза, так как у них нет митохондрий.

Образовавшиеся в результате гликолиза триозы, и в первую очередь пировиноградная кислота, вовлекаются в дальнейшее окисление, происходящее уже в самих митохондриях. При этом происходит использование энергии расщепления всех химических связей, что приводит к выделению СО2, к потреблению кислорода и синтезу большого количества АТФ. Эти процессы связаны с окислительным циклом трикарбоновых кислот и с дыхательной цепью переноса электронов, где происходит фосфорилирование АДФ и синтез клеточного “топлива”, молекул АТФ (рис. 209).

316

В цикле трикарбоновых кислот (цикл Кребса, или цикл лимонной кислоты) образовавшийся в результате гликолиза пируват сначала теряет молекулу СО2 и, окисляясь до ацетата (двууглеродное соединение), соединяется с коферментом А. Затем ацетилкоэнзим А, соединяясь с оксалацетатом (четырехуглеродное соединение), образует шестиуглеродный цитрат (лимоную кислоту). Затем происходит цикл окисления этого шестиуглеродного соединения до четырехуглеродного оксалацетата, снова связывание с ацетилкоэнзимом А, и затем цикл повторяется. При этом окислении выделяются две молекулы СО2, а электроны, освободившиеся при окислении, переносятся на акцепторные молекулы коферментов (NAD-никотинамидадениндинуклеотид), которые вовлекают их далее в цепь переноса электронов. Следовательно, в цикле трикарбоновых кислот нет самого синтеза АТФ, а идет окисление молекул, перенос электронов на акцепторы и выделение СО2. Все описанные выше события внутри митохондрий происходят в их матриксе.

Выделенные митохондрии обладают способностью осуществлять окисление пирувата до СО2 и способны к синтезу АТФ. Если взвесь митохондрий подвергнуть воздействию ультразвука, то после разрыва митохондриальных мембран компоненты матрикса освобождаются и переходят в среду выделения. После такого разрушения можно осадить мембраны митохондрий и анализировать их функциональные активности.

Было обнаружено, что во фракции, свободной от мембран, представляющей собой компоненты матрикса, обнаруживаются ферменты, участвующие в цикле трикарбоновых кислот. Следовательно, в матриксе локализованы ферменты этого цикла, которые находятся в свободном, не связанном состоянии с митохондриальными мембранами, за исключением сукцинатдегидрогеназы. Кроме того, в состав матрикса входят ферменты окисления жирных кислот; основной продукт окисления жирных кислот – ацетилкоэнзим Α – тоже в матриксе поступает в цикл трикарбоновых кислот, в котором он подвергается дальнейшему окислению до СО2 и Н2О В матриксе митохондрий происходит

317

также окисление некоторых аминокислот, поступающих в цикл трикарбоновых кислот.

Остальные события, связанные с дальнейшим переносом электронов и синтезом АТФ связаны с внутренней митохондриальной мембраной, с кристами митохондрий.

Освободившиеся в процессе окисления в цикле трикарбоновых кислот электроны, акцептированные на коферментах, переносятся затем в дыхательную цепь (цепь переноса электронов), где они соединяются с молекулярным кислородом, образуя молекулы воды.

Дыхательная цепь представляет собой ряд белковых комплексов, встроенных во внутреннюю митохондриальную мембрану (рис. 210). Существуют три главных ферментных комплекса. Первый, NADHдегидрогеназный комплекс принимает электроны от NADH и переносит их во второй комплекс, комплекс в-С1, который в свою очередь, переносит их на цитохромоксидазный комплекс, а он их передает на кислород, в результате чего образуется вода. На этом окисление заканчивается.

Как и полагается, окисление исходного субстрата привело к выделению СО2 и воды, но при этом не выделилась тепловая энергия, как при горении, а образовались молекулы АТФ. Они были синтезированы другой группой белков, не связанных прямо с окислением. Было найдено, что во внутренних митохондриальных мембранах на поверхности мембран, смотрящих в матрикс, располагаются крупные белковые комплексы, ферменты, АТФ-синтетазы. В электронном микроскопе во фракции внутренних митохондриальных частиц видны так называемые “грибовидные” тельца сплошь выстилающие поверхность мембран, смотрящую в матрикс. Эти тельца имеют как бы ножку и головку. Диаметром 8-9 нм. Было обнаружено, что эти тельца представляют собой белковый комплекс, состоящий из 9 субъединиц – АТФ-синтетазу. Следовательно, во внутренних мембранах митохондрий локализованы ферменты как окислительной цепи, так и ферменты синтеза АТФ (рис. 201б).

318

Дыхательная цепь – это главная система превращения энергии в митохондриях. Здесь происходит последовательное окисление и восстановление элементов дыхательной цепи, в результате чего высвобождается небольшими порциями энергия. За счет этой энергии в трех точках цепи из АДФ и фосфата образуется АТФ. Поэтому говорят, что окисление (перенос электронов) сопряжено с фосфорилированием (АДФ + Фн →АТФ, т.е. происходит процесс окислительного фосфорилирования.

В результате многократной оборачиваемости субстратов в цикле Кребса происходит полное окисление поступивших продуктов первичного гликолитического окисления, и затем в цепи окислительного фосфорилирования происходит максимальное использование освободившейся при окислении энергии для синтеза АТФ.

Было высказано предположение, что выделяющаяся при транспорте электронов энергия запасается в виде градиента протонов на мембране. При этом на внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий возникает повышенная концентрация положительно заряженных ионов водорода. Возникший при этом протонный градиент является движущей силой в синтезе АТФ (рис. 211).

Это предположение стало затем теорией, хемиосмотической теорией сопряжения окисления субстратов с синтезом АТФ. Как оказалось, при переносе электронов в митохондриальной мембране каждый комплекс дыхательной цепи направляет свободную энергию окисление на перемещение протонов (положительных зарядов) через мембрану, из матрикса в межмембранное пространство, что приводит к образованию разности потенциалов на мембране: положительные заряды преобладают в межмембранном пространстве, а отрицательные – со стороны матрикса митохондрий. При достижении определенной разности потенциалов (220 мВ) белковый комплекс АТФсинтетазы начинает транспортировать протоны обратно в матрикс, при этом превращает одну форму энергии в другую: образует АТФ из АДФ и

319

неорганического фосфата. Так происходит сопряжение окислительных процессов с синтетическим, с фосфорилированием АДФ. Пока происходит окисление субстратов, пока происходит перекачка протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану – идет сопряженный с этим синтез АТФ, т.е. происходит окислительное фосфорилирование.

Эти два процесса могут быть разобщены. Можно снять разность потенциалов на митохондриальной мембране, или механически ее нарушить, или с помощью химических соединений (например, динитрофенола) сделать в ней диффузионные каналы. При этом будет продолжаться перенос электронов, будет продолжаться окисление субстрата, но синтеза АТФ уже происходить не будет. В этом случае энергия, освобождающаяся при окислении будет переходить в тепловую энергию.

Окислительное фосфорилирование у бактерий

У прокариотических клеток, способных к окислительному фосфорилированию, элементы цикла трикарбоновых кислот локализованы прямо в цитоплазме, а ферменты дыхательной цепи и фосфорилирования связаны с клеточной, плазматической мембраной. Это было вначале показано цитохимическими методами. Так, фермент сукцинатдегидрогеназа связан с плазматической мембраной и с ее выпячиваниями, выступающими внутрь цитоплазмы, с так называемыми мезосомами (рис. 212). Надо отметить, что такие бактериальные мезосомы могут быть связаны не только с процессами аэробного дыхания, но и у некоторых видов участвовать в делении клеток, в процессе распределения ДНК по новым клеткам, в образовании клеточной стенки и т.д. На плазматической мембране в мезосомах некоторых бактерий локализуются также факторы сопряжения окисления и синтеза АТФ. В электронном микроскопе во фракциях плазматических мембран бактерий обнаружены сферические частицы, аналогичные тем, которые были найдены в митохондриях эукариотических клеток. Таким образом, у бактериальных

320