Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:патенты / Сборник патентов_11130
.pdf
патока), свекловичная меласса, 90 гидрол (маточный раствор, образующийся при кристаллизации кукурузного
сахара) и тому подобное. Конечно, могут быть использованы и другие сбраживаемые углеводы, например, те,
которые описаны в характеристиках ферментации, рассмотренных выше, или могут применяться смеси
различных типов углеводов. Например, кукурузный сироп, содержащий глюкозу и декстрин, может оказаться
вполне подходящим для этой ферментации, а 100 равных смесей зерновой браги и простых сахаров
обеспечат неплохой выход растворителей.
При проведении ферментации товарных заторов, например, мелассы, 105 с использованием бактерий группы
Clostridium saccharoacetobutylicum, количество образующихся растворителей, как правило, находится в
следующих диапазонах:
Бутиловый спирт: более 64%; обычно 110 68-73% Ацетон: более 18%; обычно 26-2% Этиловый спирт: менее
6%; обычно 1-3% 115 Газообразные продукты брожения, диоксид углерода и водород, обычно имеют
следующий порядок величины: CO2/H2 (по объему) = 2/1.
Способ осуществления данного изобретения, пожалуй, лучше всего проиллюстрировать следующими
конкретными примерами:
ПРИМЕР I.
Был приготовлен и стерилизован 7%-ный раствор мелассы. Затем в эту заторную массу вносили около 3,5%
по объему культуры Clostridium sacharo-acetobutylicum второго поколения, выделенной из почвы, и
поддерживали температуру брожения 28 °C. После завершения брожения (130 Дж) анализ показал
концентрацию растворителей 5,91 грамма на литр.
ПРИМЕР II.
Затор, содержащий 3,35% сахара в виде кубинской мелассы. 0.27% Смесь, состоящая из глютеновой муки и
0,027% (NH4)2SO4, была доведена до pH 5,73, стерилизована, инокулирована культурой Clostridium
saccharo-acetobutylicum oc и выдерживалась при температуре ферментации 30°C в течение 72 часов. Анализ
ферментированной массы показал концентрацию растворителей 7,83 грамма на литр, что соответствует
выходу 22,4% по весу сахара в исходном сусле. Было установлено, что соотношение растворителей
следующее:
Ацетон Этиловый спирт Бутиловый спирт 22/8 4/3 72%/9 72/9 Следует понимать, разумеется, что наше
изобретение не ограничивается конкретными примерами или условиями, изложенными выше. Могут быть
использованы известные методы ферментации, и такие методы затирания или ферментации, которые
естественным образом пришли бы в голову специалисту в данной области, входят в объем данного
изобретения. Например, если источник углеводов не обеспечивает достаточного количества доступного азота
или необходимых минеральных элементов, таких как фосфаты и тому подобное, в затор можно добавить
общеизвестные питательные вещества, чтобы компенсировать такой дефицит. Начальная концентрация
ионов водорода в заторной смеси может быть отрегулирована до оптимального значения для выбранной
конкретной культуры, но в большинстве случаев ее можно установить на уровне pH 7 или несколько ниже.
Температуру для ферментации также можно отрегулировать до оптимальной для используемой культуры, но
в целом температура около 30 °C будет считаться удовлетворительной.
В целом, любые модификации процедуры или использование любых эквивалентов, которые естественным
образом пришли бы в голову специалисту в данной области, следует понимать как подпадающие под объем
нашего изобретения.
Подробно описав и определив природу нашего изобретения и способ его осуществления, мы заявляем, что
то, что мы
=== НАЧАЛО ФАЙЛА: patent_415312.txt ===
ССЫЛКА: https://translationportal.epo.org/emtp/translate/?ACTION=description-retrieval&COUNTRY=GB&ENGINE=
google&FORMAT=docdb&KIND=A&LOCALE=sq_AL&NUMBER=415312&SRCLANG=EN&OPS=ops.epo.org/3.2&T
RGLANG=ru
========================================
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ GB415312A
[]
[Второе издание.] ]
ПАТЕНТНАЯ СПЕЦИФИКАЦИЯ
Дата проведения конвенции (США). Январь. 3, 1933.
Дата подачи заявки (в Соединенном Королевстве): декабрь. 27, 1933. № 36,411 /33.
Полное техническое задание принято в августе. 23, 1934.
..:. ПОЛНАЯ СПЕЦИФИКАЦИЯ.
Усовершенствования в производстве бутилового спирта методом ферментации или связанные с ним.
Мы, компания COMMERCIAL SOLVENTS CORPORATIV, корпорация, учрежденная в соответствии с
законодательством штата Мэриленд, Соединенные Штаты Америки, по адресу: Территория, штат Индиана,
Соединенные Штаты Америки (правообладатели Джона Митлера и Дэвида А. Л. Эга), настоящим заявляем о
характере данного изобретения и о способе его осуществления, которые будут подробно описаны и
установлены в следующем заявлении:
Наше изобретение относится к производству бутилового спирта и других ценных продуктов путем
ферментации растворов, содержащих сахара.
В соответствии с одной из особенностей настоящего изобретения, усовершенствованный процесс
производства нормального бутилового спирта, изопропилового спирта, этилового спирта и ацетона включает
в себя обработку ферментируемой углеводной массы, содержащей инвертированный углевод в качестве
основного ферментируемого углевода и деградированный белковый азот, бактериями группы Clostridium
propyl butylicum при температурах от 23°C до 38°C, а также контроль кислотности массы в процессе
ферментации, благодаря чему конечная концентрация ионов водорода, обеспечиваемая действием бактерий,
находится в диапазоне pH от 5,0 до 6,5.
Настоящее изобретение также предусматривает способ производства нормального бутилового спирта,
изопропилового спирта, этилового спирта и ацетона, который включает в себя обработку ферментируемой
углеводной массы, содержащей инвертированный углевод в качестве основного ферментируемого углевода и
деградированный белковый азот, при температурах от 25°C до 36°C, действием бактерий, обладающих
следующими характеристиками, в оптимальных условиях ферментации:
(a) Неспособность разжижать желатин или использовать неразложившийся белок в качестве единственного
источника азота; (b) Способность использовать разложившийся белок, включая аммиак, в качестве
единственного источника азота; (c) Неспособность получать значительные выходы бутилового и
изопропилового спиртов из крахмала или сахарозы в качестве единственного источника углеводов; (d)
Неспособность получать высокие выходы бутилового и изопропилового спиртов из неинвертированной
мелассы в качестве единственного источника углеводов; (e) Способность получать высокие выходы
бутилового и изопропилового спиртов из глюкозы или инвертированной мелассы в качестве единственного
источника углеводов, контролируя при этом кислотность затора во время ферментации, так чтобы конечная
концентрация ионов водорода, обеспечиваемая действием бактерий, находилась в диапазоне pH от 5,0 до
6,5.
Ранее было известно, что растворы сахара могут быть ферментированы с помощью организмов группы
Clostridium butyricum с образованием различных продуктов, таких как уксусная и масляная кислоты, бутиловый
спирт и т. д. (см., например, «Руководство Берги по определению бактерий», Williams & Wilkins, Балтимор,
1930, стр. 434-435).
Однако выход бутилового спирта во всех случаях был настолько низким, что исключал коммерческое
использование таких процессов ферментации. Таким образом, несмотря на то, что неочищенные растворы
сахара представляют собой самый дешевый источник сырья, до настоящего времени производство
бутилового спирта осуществлялось главным образом путем ферментации крахмальной массы с помощью
организмов типа Clostridium acetobutylicurm (Weizmann).
Организмы группы Clostridium butyricum никогда не были доказаны как ферментирующие агенты, обладающие
коммерчески значимыми свойствами, и были отброшены как представители длинного списка
микроорганизмов, производящих желаемые продукты, но в таких малых количествах, что это экономически
нецелесообразно. Бактерии этой группы (95%) продуцируют кислоты и нейтральные конечные продукты,
аналогичные тем, которые производят бутиловые организмы, такие как Clostridium acetobutylicum (Weizmann),
и имеют пикообразную кривую кислотности, что соответствует общему типу кислотности, производимых
организмом Weizmann. Бутилсодержащие организмы типа Clostridium acetobutylicum поддерживают
оптимальную концентрацию ионов водорода в заторной массе 105 без необходимости контроля с помощью
нейтрализующих агентов или подобных веществ. В действительности было доказано, что добавление
веществ, изменяющих концентрацию ионов водорода, оказывает определенное вредное воздействие на
некоторые из этих организмов. Например, Гримберт (Ann. de l'Inst.
Прошлое. 7, 353, ДюКло (Ann. de l'Inst. Past. 9, 811), и Маккой и др. (Jour. Инфекция. Исследования (Dis., 39,
457) показали, что добавление карбоната кальция в затор приводит к заметному снижению выхода бутилового
спирта.
Таким образом, исходное предположение заключалось в том, что любые попытки снизить концентрацию
ионов водорода в процессе ферментации, осуществляемые организмами группы Clostridium butyricum, также
приведут к снижению выхода нейтральных конечных продуктов.
Однако мы обнаружили, что относительно большая группа бактерий, обозначенная здесь как Clostridium propyl
butylicum, способна производить высокие выходы бутилового спирта из товарных заторов, содержащих сахар,
при соблюдении определенных условий ферментации, особенно при точном контроле концентрации ионов
водорода с помощью таких веществ, как карбонат кальция. В номенклатуре и описанных культуральных
характеристиках организмов, относящихся к типу Clostridium butyricum, существует такая путаница, что
невозможно с уверенностью сказать, входят ли какие-либо из них в группу, ныне обозначаемую как Clostridium
propyl butylicum. Например, культуры, выдаваемые за Clostridium pasteurianum Winogradsky (Bredemann),
Bacillus saceharobutyricum liquefaciens, Bacillus F.B. (предположительно, организм, описанный в британском
патенте Фернбаха № 21073/12), Bacillus amylobaeter A.M.
Clostridium et Bredemann и Granulobacter saccharobutyricum immobile non-liquefaciens (Schattenfroh and
Grassberger) были получены из различных коллекций и, как было установлено, относятся к классификации
Clostridium propyl butylicum, описанной в настоящем изобретении, несмотря на то, что в различных
литературных источниках эти организмы описываются как обладающие свойствами, исключающими их из
этой классификации. Таким образом, следует понимать, что настоящее изобретение включает в себя
использование любых известных из предшествующего уровня техники бактерий, обладающих фактически
указанными ниже характеристиками, независимо от характеристик, описанных в литературе. Разумеется,
следует понимать, что настоящее изобретение относится к использованию этих организмов только в новых
условиях ферментации, которые будут указаны ниже, а не к использованию этих организмов в целом, при
каких бы то ни было условиях.
Различные условия, которые, как мы обнаружили, необходимы для получения высоких выходов
растворителей организмами этой группы, включают, вкратце, 70 наличие инвертированного углевода в
качестве источника углеводов, наличие деградированного белкового материала (включая аммиак) в качестве
источника азота, температуру брожения ниже 35 °C, 75 и контроль кислотности затора во время брожения
таким образом, чтобы конечная концентрация ионов водорода, полученная под действием бактерий,
находилась в диапазоне pH 5,0-6,3, предпочтительно 80 5,8-6,1. Разумеется, другие известные условия
ферментации, обычно используемые для любого организма этого общего типа, такие как наличие
необходимых минеральных элементов, фосфатов и т. д., будут применяться обычным способом, известным
специалистам в данной области.
Наиболее важным элементом ферментации, описанной в нашем изобретении, является контроль
концентрации ионов водорода таким образом, чтобы конечное значение pOH, достигаемое действием
бактерий, находилось в пределах установленных значений. Практически во всех других известных процессах
ферментации, в которых получаются нейтральные конечные продукты, регулирование начальной
концентрации ионов водорода считается наиболее важным.
Если начальная концентрация ионов водорода будет скорректирована в пределах рабочих 100%,
ферментация будет протекать нормально, и не потребуется обращать внимание на конечную концентрацию
ионов водорода.
Однако в данном случае было установлено, что, хотя начальная концентрация ионов водорода может
значительно варьироваться, конечный pH, полученный в результате действия бактерий, должен находиться в
определенных пределах, если необходимо обеспечить высокую эффективность растворителей. 110 Мы
обнаружили, что конечный уровень pH, достигаемый действием бактерий, может контролироваться путем
добавления определенных веществ в затор в начале ферментации. Например, мы обнаружили, что если в
затор добавить карбонат кальция, карбонат бария, карбонат железа или другое нерастворимое нетоксичное
основание в количестве, достаточном для нейтрализации любой свободной кислотности, и в количестве,
превышающем это примерно на 6-8% по весу сахара, то конечный pH брожения окажется в пределах
рабочего диапазона. Хотя различные упомянутые материалы могут быть успешно использованы в этом
процессе, в большинстве случаев было установлено, что карбонат кальция особенно хорошо подходит для
этой цели и предпочтительнее с экономической точки зрения.
Однако при выборе используемого материала следует учитывать состав среды и отдавать предпочтение
материалу, который не приведет к нежелательной концентрации определенного иона металла, даже если он
обычно считается нетоксичным.
Количество карбоната кальция или другого нетоксичного нерастворимого основания, добавляемого сверх
необходимого для нейтрализации свободной кислотности затора, может несколько варьироваться в
зависимости от конкретного случая, но в целом его можно назвать составляющим от 3,5% до 13% от веса
сахара в заторе.
Различные образцы этих материалов будут отличаться по необходимому количеству в зависимости от
физических и химических свойств материала, например, от наличия значительного количества извести.
Однако в любом случае предварительная ферментация позволит специалисту в данной области определить
оптимальную концентрацию используемого карбоната кальция. Материалы такого рода, как правило, должны
быть достаточно мелко измельчены, чтобы, оседая на дне бродильного сосуда, они представляли собой
значительную поверхность для бродильного сусла. При использовании этого метода контроля концентрации
ионов водорода следует избегать чрезмерного перемешивания, чтобы предотвратить возможность фиксации
слишком большого процента кислот, образующихся на ранних стадиях брожения, и, следовательно,
нежелательное нарушение равновесия брожения. Следует четко понимать, что цель добавления основных
веществ в этом процессе состоит не в нейтрализации всех кислот, образующихся в процессе брожения, а
лишь в контроле концентрации ионов водорода таким образом, чтобы конечный уровень pH, обеспечиваемый
действием бактерий (а не нейтрализующих агентов), находился в пределах установленных значений.
Следует понимать, что наше изобретение не ограничивается конкретными средствами, используемыми для
обеспечения желаемой конечной концентрации ионов водорода. Разумеется, могут быть использованы
любые эквиваленты или модификации, которые естественным образом пришли бы в голову специалисту в
данной области. Например, точный контроль pH может поддерживаться непрерывным или полунепрерывным
добавлением щелочного вещества, такого как аммиак, на активной стадии ферментации и до тех пор, пока не
произойдет снижение кислотности. Однако механические сложности процедур подобного рода хорошо
известны специалистам в данной области. Даже незначительная чрезмерная нейтрализация в любой момент
брожения часто приводит к подавлению дальнейшего активного брожения на протяжении многих часов или
даже дней. Следовательно, автоматический электрометрический титрационный аппарат 70 был бы крайне
желателен, если бы такая процедура применялась. В любой подобной процедуре необходимо контролировать
pH таким образом, чтобы он приблизительно соответствовал значению, получаемому при использовании
указанных количеств нерастворимых основных веществ.
Ввиду сложности таких процедур мы предпочитаем обеспечивать желаемый контроль pH путем введения в
затор нерастворимых веществ до начала брожения 80.
Кроме того, с точки зрения простоты эксплуатации, мы предпочитаем контролировать кислотность сусла во
время брожения с помощью нерастворимых веществ, таких как карбонат кальция. Мы установили, что для
широкого спектра сортов мелассы добавление примерно 6-8% карбоната кальция или аналогичного вещества
от веса сахара в затор обеспечивает 90% адекватного контроля кислотности, так что конечная концентрация
ионов водорода, достигаемая действием бактерий, находится в пределах желаемых значений. Этот факт, как
можно предположить, устраняет необходимость в индивидуальной обработке каждого образца мелассы, если
только не требуется максимально возможный выход продукта.
Наиболее удовлетворительный для этой 100-процентной ферментации диапазон температур, который мы
обнаружили, находится в пределах 250°C.
до 360 °C. Будет происходить рост, и иногда активное брожение будет происходить в гораздо более широком
диапазоне, например, от 230 °C до 380 °C, но для стабильно высоких выходов растворителей температуру
необходимо поддерживать в диапазоне 280–33 °C, а предпочтительно в более узком диапазоне от 290 °C до
31 °C.
Что касается необходимых питательных веществ 110 для этой ферментации, можно сказать, что азот,
содержащийся в расщеплённом белке, имеет важное значение.
В данном документе и в прилагаемых пунктах формулы изобретения термин «деградированный белковый
азот» следует понимать как включающий продукты гидролитической деградации, такие как полипептиды,
аминокислоты и т. д., продукты метаболической деградации, такие как мочевина и т. д., а также конечный
продукт деградации — аммиак и его соли. Предпочтительно использовать аммиак, 120, но частично
разложившиеся белковые материалы, такие как дрожжевая вода, вода для замачивания и т. д., оказались
вполне удовлетворительными.
Хотя нерасщепленный белок, такой как кукурузный глютен, кукурузная зародышевая мука и тому подобное, не
может быть использован в качестве единственного источника азота, небольшие количества таких
материалов, в дополнение к аммиаку или расщепленному белку, часто дают лучшие результаты. Другие
питательные вещества, такие как минеральные элементы, например, фосфаты и тому подобное, должны
присутствовать в небольших количествах, как и в случае других известных процессов ферментации. Однако,
если используются растворы неочищенного сахара, такие как перевернутая меласса, то эти вещества, как
правило, будут присутствовать в достаточном количестве. Количество добавляемого аммиака или
деградированного белка также будет варьироваться в зависимости от используемого сырья. Например, в
некоторых образцах мелассы может быть обнаружено достаточное количество соединений аммония и других
разложившихся белков, так что добавлять их нужно совсем немного или, возможно, вовсе не нужно. В целом
можно сказать, что при использовании тростниковой мелассы в заторах содержание аммиака от 0,5 до 1,0%
по весу сахара или эквивалентное количество другого расщепленного белка даст удовлетворительные
результаты.
Ниже представлена типичная среда, которая оказалась идеально подходящей для лабораторных
ферментаций: перевернутая стеклянная среда (среда I).
Кубинская меласса с концентрацией сахара около 20% подвергается инвертированию путем нагревания с
серной кислотой в количестве, эквивалентном 5% от массы сахара, в течение 40 минут при давлении в
фунтах. По завершении процесса переворачивания добавляют около 0,7% аммиака от массы сахара, а затем
вводят достаточное количество мелкодисперсного карбоната кальция для нейтрализации оставшейся
свободной кислотности. Затем в сусло добавляют избыток карбоната кальция, составляющий примерно 6% от
массы сахара, после чего сусло разбавляют до концентрации сахара около 5% и стерилизуют в течение 30
минут при давлении 20 фунтов на квадратный дюйм. Возможно, целесообразно снизить давление пара и
увеличить время переворачивания и стерилизации, чтобы избежать карамелизации сахара из-за локального
перегрева. В данном случае 2 часа при давлении 5 фунтов примерно эквивалентны минутам при давлении 20
фунтов.
Разумеется, специалистам в этой области хорошо известно, что разные образцы мелассы различаются по
ряду параметров, таких как содержание сахара, содержание золы и тому подобное. Эти вариации,
естественно, несколько изменяют процесс затирания (в разных случаях). Например, хотя кубинская меласса
обычно содержит достаточное количество неазотистых питательных веществ, было установлено, что
добавление определенных веществ является желательным.
минеральные элементы, такие как фосфаты и тому подобные, были обнаружены в некоторых образцах
луизианской мелассы. В каждом конкретном случае специалист в данной области может определить особые
требования, если таковые имеются, путем предварительного согласования.
лиминарные брожения. Однако подобные изменения в процедуре затирания для различных типов мелассы
будут необходимы лишь для обеспечения абсолютно максимального выхода продукта. Практически во всех
случаях с помощью описанной выше процедуры можно получить весьма удовлетворительные результаты.
Бактерии, обозначенные в настоящем изобретении как Clostridium propyl butylicum и указанные так в
прилагаемых документах, включают любые бактерии, обладающие следующими характеристиками:
I. Морфологические 75 А. Палочковидные B. Спорообразующие - Клостридии и Плектридии C. Практически
неотличимы от представителей группы Clostridium butyricum II. Биохимические А. Углеводная ферментация 1.
Невозможность получения значительных выходов бутилового и изопропилового спиртов из крахмала как
единственного источника углеводов 2. Невозможность получения значительных выходов бутилового и
изопропилового спиртов из сахарозы как единственного источника углеводов 3. Неспособность стабильно
получать выход более 20% по весу сахара 95 из мунинвертированной мелассы 4. Способность получать
высокие выходы бутилового и изопропилового спиртов из глюкозы или инвертированной мелассы 100 13.
Метаболизм азота 1. Способность получать высокие выходы бутилового и изопропилового спиртов в сахарной
среде, например, в среде Герксозы, содержащей 105% аммиака в качестве основного источника азота.
Способность использовать расщепленный белок (включая аммиак) в качестве единственного источника азота
110 3. Способность использовать нерасщепленный белок в качестве единственного источника азота 4.
Неспособность разжижать желатин или вызывать более чем очень незначительный протеолиз молока. C.
Потребность в кислороде 1. Анмиробический D. Диапазон температур для производства растворителей 120 1.
От 25°C до 36°C, предпочтительно от 29°C до 31°C.
Е. Концентрация ионов водорода для производства растворителя 1. Конечное значение pH составляет 5,0–0,5
(предпочтительно 5,6–6,1).
Считается, что приведенная выше схема достаточна для того, чтобы специалист в данной области смог
идентифицировать рассматриваемые организмы. Полная характеристика, подобная той, что приведена в
Описательной таблице Общества американских бактериологов (131) 415,312 415,312, была бы не только
излишней, но и вводящей в заблуждение, поскольку разные представители этой группы организмов
различались бы по ряду незначительных деталей, не имеющих отношения к данному случаю. Все организмы,
обладающие общими характеристиками, перечисленными выше, подпадают под действие настоящего
изобретения, независимо от других свойств, которыми они могут обладать.
Ввиду неопределенности в литературе относительно методов, используемых для некоторых из упомянутых
выше биохимических тестов, мы считаем целесообразным несколько расширить кратко изложенные
характеристики. Например, характеристики ферментации, указанные в разделе «Углеводная ферментация»,
— это характеристики, определяемые в оптимальных условиях, например, в описанной выше
инвертированной мелассовой среде или в аналогичных средах, содержащих другие углеводы. Следует особо
отметить, что эти и все другие характеристики брожения, описанные в данной спецификации, относятся к
брожению товарного сусла, то есть сусла с концентрацией сахара порядка 5%. Совершенно иные результаты
могут быть получены при использовании лабораторных питательных сред с более низким содержанием
сахара.
Следует также отметить, что подобные характеристики ферментации относятся к нормальным, стабильным
результатам, а не к аномально низким или высоким показателям, которые иногда могут быть получены с
любой культурой.
Ниже в качестве иллюстрации приведен типичный тест на ферментацию углеводов у организма,
относящегося к этой группе:
Состав среды, % по весу затора. Выход растворителя (% от общего количества углеводов): II 5% кукурузного
затора (следы); III 20% картофельного затора (следы); 0,1% (NH4)2SO4; IV 25% картофельного затора; 2,6%
дрожжевой воды; 0,6% CaCO3; V 5,0% глюкозы; 26,0% (NH4)2SO4; 0,3% (NH4)2HPO4; 0,05% NH4Cl; 0,05%
MgSO4; 0,6% CaCO2. Начальный pH отрегулирован до 6,4. Номер среды.
Состав (%) по весу затора. Растворитель. Выход (% от углеводов) VI 5% сахарозы 3,2 0,1% (NH4)2SO4 0,15%
K2HPO4 0,05% MgSO4 0,5% CaCO3 Начальный pH отрегулирован до 6,1 VII 5,0% сахара в виде
инвертированной кубинской мелассы 30,7 0,04% NH4 в виде сульфата аммония 0,5% CaCO3 VIII 5,5% сахара
в виде неинвертированной мелассы 9,0 0,04% NH4 в виде сульфата аммония 0,5% CaCO3 Что касается
метаболизма азота, то под нерасщепленными белковыми материалами подразумеваются такие материалы,
как кукурузный глютен и кукурузная зародышевая мука, под расщепленными белками — такие материалы, как
дрожжевая вода, вода для замачивания и мочевина, а разжижение желатина относится к таким тестам, как
инкубация на питательном желатине, содержащем 2% глюкозы. Например, культуры, выращенные методом
прокола на такой среде, инкубировали при 22 °C, а культуры, выращенные методом встряхивания, — при 30
°C. В каждом случае наблюдался отличный рост, но по истечении 30 дней желатин во всех случаях
затвердевал при 22 °C.
Протеолиз молока включает в себя такие тесты, как стандартный лакмусовый тест на молоко.
В лакмусовом молоке микроорганизмы этой группы сначала восстанавливают лакмус, а затем образуют
кисловатый творог, несколько напоминающий сычужный фермент, который демонстрирует лишь
незначительное переваривание в конце 100 из 30 дней. Следующий пример иллюстрирует тип теста, который
может быть проведен для определения потребности организмов в азоте:
Средний состав % по выходу растворителя 105 Масса затора (% по сахару) IX 5,0% инвертный сахар 25,0
0,15% K2HPO4 0,1% (NHI)2SO4 0,05% MgSO4 0,5% CaCO3 X 5,0% глюкоза 34 0,6% CaCO0 в 10% дрожжевой
воде 6415,312 Средний состав % по массе затора Выход растворителя (% по сахару) XI 5,0% инвертный сахар
2,0 0,15% K2HPO4 0,05% MgSO4 0,3% кукурузный зародыш 0,3% кукурузный глютен 0,5% CaCO3 Следует
отметить, что использование аммиака указано как основной источник азота, а не единственный источник для
оптимального производства растворителя.
Эти организмы могут использовать аммиак в качестве единственного источника азота, в некоторых случаях с
оптимальным выходом растворителя, но для стабильно высокого выхода растворителей предпочтительно
наличие небольшого количества какого-либо другого деградированного белкового материала в дополнение к
аммиаку. Однако это дополнительное количество обычно присутствует в таких материалах, как меласса,
поэтому использование одного только аммиака позволит получить оптимальные выходы.
Термин «анаэробный», используемый в приведенном выше описании, относится к неспособности организмов
расти на поверхности питательного глюкозного агара при инкубации в эробных условиях. Однако эти
организмы способны развивать и производить удовлетворительную ферментацию в глубокой жидкой среде
при аэробной инкубации благодаря анверобным условиям, которые они поддерживают в среде.
Указанные диапазоны температуры и концентрации ионов водорода не представляют собой весь диапазон, в
котором будет происходить рост, а лишь диапазоны, в которых можно получить высокие выходы
растворителей при работе в других указанных условиях.
Кроме того, указанные соотношения растворителей, характерные для данного организма, являются теми,
которые обычно стабильно получаются в оптимальных условиях, и не относятся к аномальным
соотношениям, которые иногда могут наблюдаться в любой из культур. Кроме того, следует понимать, что
указанные характеристики этих организмов не ограничиваются конкретными методами и датами, указанными
выше. Эти данные приведены лишь в качестве иллюстрации, тогда как характеристики организмов,
заявленные в настоящем изобретении, в целом соответствуют описанным в нем характеристикам.
Организмы этой группы широко распространены в природе и могут быть выделены из самых разных
источников, таких как почва, гнилая древесина, зерно, кукурузные стебли, речной ил и тому подобное. Ввиду
перечисленных выше характеристик, специалист в данной области может выделить эти организмы из таких
источников известными методами выделения. Разумеется, как это очевидно специалисту в данной области,
эти организмы невозможно выделить из каждого образца исследуемого материала. Однако, если опробовать
несколько различных материалов, то практически всегда удастся получить хорошую культуру. Приведенный
ниже конкретный пример иллюстрирует один из методов, применимых для этой цели.
Подготавливается большое количество колб, скажем, по двадцать колб каждого из следующих типов сред:
Средний номер
Состав (в процентах по весу) затора I (как описано выше): XII 3,0% глюкоза 0,1% (NI-14)2SO4 0,15%
(NH4)2HPO4 0,05% NH4Cl 0,05% MgSO4 0,3% CaCO3 p11 доведен до 6,0. Эти среды стерилизуются обычным
способом и, пока они еще горячие, например, 80-85 °C, инокулируются образцами почвы, ила, кукурузы,
кукурузных стеблей, гнилой древесины и тому подобного. Колбы выдерживают при температуре инокуляции
90°C в течение короткого времени, например, от 1 до 3 минут, а затем быстро охлаждают до 320°C и
инкубируют при этой температуре. Культуры, демонстрирующие наиболее интенсивное брожение по
истечении 95 ± 48 часов, отбираются для дальнейшего исследования и оставляются для спорообразования в
течение как минимум 5 дней при температуре 32°C. Затем культуры переносят в колбы со средой I, пока
последняя еще горячая, например, 95°C. После выдержки при этой температуре не более одной минуты их
быстро охлаждают до 32°C и инкубируют при этой температуре. Эту процедуру можно повторить несколько
раз для дальнейшего обогащения культур, но, как правило, после третьего переноса часть культур покажет
достаточную активность, чтобы оправдать количественное определение растворителей.
Культуры, показавшие удовлетворительный выход сахара (например, 15% или более по весу), могут быть
протестированы на средах I и XIII (которые представляют собой ту же среду, что и среда I, но содержат
неинвертированную мелассу), или же культуры могут быть высеяны на чашки Петри на этом этапе, если это
необходимо. В первом случае культуры, показавшие хорошие результаты на среде I и плохие — на среде XIII,
отбираются для проведения еще 120 количественных ферментаций. Если результаты этих процессов
ферментации покажут содержание сахара. Получены следующие соотношения растворителей:
Бутиловый спирт – более 60%, обычно 65-70%.
Изопропиловый спирт — выше 15%; обычно 16-20%. Этиловый спирт — ниже 10%, обычно 3-4%. Ацетон —
ниже 15%; обычно 5-10%.
Газы, выделяющиеся в процессе брожения, состоят из диоксида углерода и водорода в соотношении CO2/H2
порядка 3/1.
Следующие конкретные примеры послужат иллюстрацией процесса настоящего намерения:
ПРИМЕР I.
В среду I, содержащую 5% сахара, вносили 3% культуры четвертого поколения, полученной из гнилой
древесины, и инкубировали при температуре 30-32 °C в течение 72 часов. Затем были определены выход
продукта и соотношение растворителей, которые оказались следующими:
При использовании растворителей с высоким выходом, содержащих бутиловый спирт, изопропиловый спирт,
этиловый спирт и ацетон в пределах, указанных ниже, вероятно, были получены желаемые культуры. При
желании их можно дополнительно очистить методом посева на чашки Петри.
Если культуры высевают после первой количественной ферментации, это можно сделать обычным способом,
используя такие среды, как стандартный глюкозно-дрожжевой агар, стандартный питательный агар,
содержащий 2,0% глюкозы и 0,1% (NI14)2SO4, и тому подобные. Затем эти чашки Петри можно инкубировать
в анаэробных условиях при температуре 32 °C, и после появления признаков роста колонии можно
количественно протестировать на среде I после нескольких пересевов в течение 24 часов на аналогичную
среду. Затем, на основе количественных результатов, можно выбрать необходимые культуры. При желании
можно провести дополнительное посевное культивирование для отбора перспективных штаммов.
Культуры этих бактерий можно хранить обычным способом в виде споровых культур, но если споровые
культуры не хранятся на сухой стерильной почве или какой-либо высокобуферизованной среде, их следует
пересаживать каждые 10 дней на среду I, содержащую 3-5% сахара, и давать им прорасти.
Разумеется, следует понимать, что описанные выше процедуры изоляции носят лишь иллюстративный
характер и могут быть изменены любым способом, известным специалистам в данной области.
Кроме того, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается использованием культур,
выделенных этим или любым другим методом; однако, как уже было сказано ранее, оно включает в себя
любые ранее полученные бактерии из любого источника, обладающие описанными здесь характеристиками.
При использовании бактерий этой группы для крупномасштабных ферментаций необходимо соблюдать
определенные меры предосторожности в отношении инокулянта, чтобы обеспечить стабильно высокую
урожайность. Количество используемого инокулянта должно составлять от 2 до 5% по объему,
предпочтительно 3-4%. Кроме того, в качестве инокулянта следует использовать как минимум второе
поколение, выведенное из споровой стадии, а предпочтительно четвертое-шестое поколение. Разумеется, в
крупномасштабных операциях это легко может быть достигнуто путем последовательных переливаний,
необходимых для накопления требуемого объема инокулянта. Перенос культур можно производить через 24
часа на среду типа I, содержащую 3-5% сахара.
В результате ферментации коммерческих сахарных сред, содержащих около 5% сахара, например, 10%
мелассы, получают бутиловый спирт, изопропиловый спирт, этиловый спирт и ацетон. Выход обычно
составляет от 28 до 32% от общего количества растворителей по весу. Соотношение растворителей Выход %
по сахару 28,8 Этиловый и бутиловый спирты Изопропиловый спирт 66,3 22,9 Ацетон 10,8 ПРИМЕР II. 95
Среду I, содержащую 5% сахара, инокулировали примерно 3% культуры четвертого поколения,
предположительно Clostridium pasteurianum Winogradsky (Bredemann), и инкубировали при температуре 30-32
°C в течение 72 часов. Затем были определены выход продукта и соотношение растворителей, которые
оказались следующими:
Соотношение растворителей Выход % по сахару Этиловый и бутиловый спирты Изопропиловый спирт 32,0
67,3 Ацетон 7,9 ПРИМЕР III.
Среда I, содержащая 5,0% сахара, инокулируется примерно 3% культуры четвертого поколения, полученной
из колонии, посеянной на чашку Петри с культурой, полученной из гнилой древесины. Затем ферментацию
проводили обычным способом при температуре 3032 °C. Выход продукта и соотношение растворителей
оказались следующими:
415,312 415,312 Соотношение растворителей Этиловый и Бутиловый изопропиловый спирт спирт Ac 68,3 25,8
ПРИМЕР V Среда VII, содержащая 5% кукурузного сахара, была инокулирована четвертым поколением
культуры, полученной из сгнившей древесины цетона, и ферментация проводилась обычным способом. Были
получены следующие значения выхода 5,9 и соотношения растворителей:
Пример IV. Соотношение растворителей.
Среда I, содержащая 5,0% сахара, инокулированная примерно 3% культуры, позволила получить колонию при
посеве на чашки Петри, соответствующую бактерии Bacillus F.B. Ферментация проводилась обычным
способом, выход продукта и соотношение растворителей были следующими:
Соотношение растворителей Выход % по сахару 31,1 Этиловый и бутиловый изопропиловый спирт спирт A(
67,2 27,1 ар был четвертым по результатам вращения порта и Выход % по сахару 27,3 Этиловый и бутиловый
изопропиловый спирт спирт 75,6 20,8 Ацетон 30 3,6 )und to Следующие результаты являются
репрезентативными для ферментации среды I, содержащей 5% сахара в виде кубинской мелассы. Эта среда
представляет собой недорогую заторную массу, пригодную для промышленного брожения, а стабильно
высокие выходы и высокое содержание бутилового спирта, показанные при низком содержании цетона,
продемонстрируют желательность данного процесса с экономической точки зрения5,7.
Соотношение растворителей Выход растворителя % по сахару Этиловый и бутиловый спирты Изопропиловый
спирт Выход газа Ацетон % по сахару 30,6 68,6 20,6 10,8 46,4 72 28 30,0 67,6 23,2 9,2 55,7 75 25 30,0 67,5 26,3
6,2 42,6 76 24 Следует понимать, конечно, что приведенные выше примеры, в качестве иллюстрации, не
следует рассматривать как ограничивающие изобретение конкретными используемыми материалами или
методом. Например, могут быть использованы и другие источники инвертированных углеводов, такие как
древесный сахар, гидролизованная свекловичная меласса, гидрол (маточный раствор, образующийся при
кристаллизации кукурузного сахара), гидролизованная сыворотка и тому подобное. Однако необходимо
обеспечить практически полный гидролиз или инверсию любого из используемых источников углеводов.
Например, древесный сахар и гидрол, хотя и содержат большой процент простых сахаров, также содержат
значительное количество полисахаридов, которые следует дополнительно подвергнуть инвертированию,
прежде чем использовать их в данном процессе. Аналогичным образом могут быть использованы различные
другие источники азота, образующегося в результате распада белка, такие как аминокислоты, мочевина и
тому подобное.
В целом можно сказать, что эквиваленты и модификации процедуры, которые естественным образом пришли
бы в голову специалисту в данной области, могут быть использованы без выхода за рамки данного
изобретения. Контроль за ионами водорода может осуществляться также с помощью материалов, отличных
от упомянутых конкретно. Например, могут использоваться другие нетоксичные материалы, которые
практически нерастворимы в воде, или растворимые материалы, если они добавляются таким образом, чтобы
имитировать действие нерастворимых материалов в указанных количествах.
Под термином «инвертированный углевод», используемым в прилагаемых пунктах формулы изобретения,
понимаются сбраживаемые монозные сахара и сбраживаемые продукты инверсии высших углеводов,
например, гексозных сахаров.
Подробно описав и определив природу нашего изобретения и способ его осуществления, мы заявляем, что
то, что мы
Соседние файлы в папке патенты