Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Основы биотехнологии. Курс лекций.pdf
Основным физиологическим показателем, характеризующим
кинетические свойства культуры, является удельная скорость роста ju=1/ч,
величина которой зависит от концентрации субстрата и константы К
.
S
Существует много кинетических моделей роста клеток и одна из них
модель Ж. Моно, уравнение которой отражает влияние одного субстрата на
скорость изменения концентрации биомассы.
Уравнение материального баланса. Эти уравнения являются
выражением закона сохранения веществ и записываются как баланс всех
статей прихода и расхода данного вещества в единицу времени. Так,
например
для биомассы:
dx/dt=D(X
где dx/dt-скорость изменения концентрации биомассы во времени; D (X
–x) + mx – mx,
BX
BX
–x)-
разница скоростей подачи и удаления биомассы из аппарата; + mx -
скорость биомассы в аппарате; – mx,- скорость автолиза биомассы.
В этом выражении D-скорость разбавления, X
– концентрация
BX
биомассы на входе в аппарат (в случае, если моделируется одиночный или
первый по ходу каскада аппарата, X
=0); Х-концентрация биомассы на
BX
выходе.
Для субстратов уравнение материального баланса записывается в виде
ds/dt=D(S
–s) – qsx +Qs, где Qs – член уравнения, появляющийся для
BX
газообразный субстратов (кислород, метан и т.д.) и характеризующийся
скорость растворения это субстрата в культуральной жидкости, S
и s-
BX
концентрация субстратов на входе и на выходе соответственно, qs – удельная
скорость потребления субстрата.
На скорость роста биомассы может оказывать влияние концентрация
продуктов метаболизма в среде, окружающей клетку. Тогда к двум
уравнениям, описывающим динамику концентрации биомассы и субстрата в
непрерывном процессе культивирования, следует добавить третье уравнение,
выражающее динамику концентрации продуктов метаболизма
dp/dt =1)(p
– p) + qp*x – Qp,
BX
где dp/dt – скорость изменения концентрации продуктов метаболизма в среде
во времени; Qp – скорость инактивации продуктов в ходе процесса (в случае,
если продукт нестабилен); p
– концентрация продуктов на входе (она равна
BX
нулю, если это первый аппарат в каскаде или одиночный аппарат); p –
концентрация продуктов на выходе; qp – удельная скорость образования
продукта.
Должно быть столько уравнений для метаболитов, сколько имеется в
культуральной жидкости продуктов метаболизма, существенно влияющих на
ход процесса (субстрат) или являющихся полезными (вредными) продуктом
с
точки зрения потребностей человека. Для летучих (газообразных)
41
метаболитов типа растворенного СО2 в правую часть уравнений добавляется
отрицательный член Qp массобмена.
В России основоположником математического моделирования процессов
культивирования в микробиологии является Н. Д. Иерусалимский.
Установлено, что на скорость роста биомассы может оказывать влияние
концентрации продуктов метаболизма в среде, окружающей клетку. Тогда к
двум уравнениям, описывающим динамику концентрации биомассы и
субстрата в непрерывном
процессе культивирования, следует добавить
третье уравнение, выражающее динамику концентрации продуктов
метаболизма. Полученное уравнение известно как формула МоноИерусалимского
где µ(S) – прирост биомассы за счет поглощения субстрата.
Уравнение кинетики роста, образования продуктов, потребления
субстратов, автолиза биомассы и инактивации продуктов являются
специфическими для микробиологических процессов. Математическое
описание кинетики этих процессов отличается
от традиционной химической
кинетики, поскольку все процессы осуществляются с участием
биокатализаторов – ферментов. Причем субстрат в процессе превращения в
организованную биомассу или продукт метаболизма проходит весьма
большое число промежуточных стадий биохимических ферментативных
реакций.
Поскольку большинство биохимических реакций осуществляется в
клетках микроорганизмов, в микробиологический кинетике принято в
качестве выходных параметров использовать не
абсолютных значения
скоростей реакций, а удельные, отнесенные к единице веса микробной
массы. Определенный компромисс в использовании теоретических
представлений о процессе и имеющихся результатов его теоретических
представлений о процессе и имеющихся результатов его эксперементального
изучения обусловил широкое применение эксперементально аналитического метода составления моделей. Применительно к
математическому описанию непрерывного процесса культивирования
микроорганизмов
это означает построение моделей на основе упрощенного
представления о механизме микробиологического синтеза культуры в целом
и использования балансовых соотношений: баланса по веществам, и баланса
по теплу, т. е. теплового баланса ферментера.
Выбор той или иной схемы протекания процесса означает принятие
определенных допущений, упрощающих реальный процесс. Допущения
могут быть следующими:
1) скорость
процесса массопередачи в культиваторе не лимитирует
роста и развития микроорганизма;
42
2) изменением состава популяции за счет мутации исходного штамма,
эффекта отмирания и других причин нестандартности свойств популяций
можно пренебречь;
3) учитываются только основные результирующие процессы
жизнедеятельности организма - процесс потребления лимитирующего
субстрата и процесс роста популяций клеток;
4) термодинамические (температура, давление) и параметрические (рН,
Еh, и др.) переменные стабилизируются;
5) гидродинамический режим близок к
идеальному смещению;
6) рабочий объем культиватора меняется несущественно.
Основные факторы, влияющие на рост и развитие микробов, можно
разделить на две группы: внутриклеточные факторы, обусловленные
структурой и специфическими особенностями бактерии, и внеклеточные
факторы, т. е. условия внешней среды (табл.3).
В зависимости от числа учитываемых факторов внешней среды,
влияющих на удельную скорость роста
, кинетические уравнения можно
подразделить на две большие группы: однофакторные и многофакторные.
В некоторых случаях в уравнениях можно учитывать только один из
факторов, так как остальные либо не изменяются в моделируемых рабочих
условиях культивирования, либо изменяются в таких пределах, что их
изменение не отражается на скорости роста.
Таблица 3
Основные факторы среды,
определяющие рост и биосинтетическую
активность продуцента
Фактор Роль фактора
Состав и концентрация
Обеспечивает метаболизм
питательных веществ
Концентрация продукта
Замедляет биохимические реакции
(ингибиторов)
рН (логарифм
концентрации водородных
Оптимизирует скорости биохимических
реакций (3,5-9,0)
ионов)
Температура Оптимизирует скорости биохимических
реакций (20-70*С)
Осмотическое давление Определяет границы жизни (0,6-0,998 Мпа)
Содержание растворенного
кислорода
Для аэробов обеспечивает метаболизм, является
акцептором ионов водорода, ингибирует
развитие анаэробов
43
Содержание СО2 Источник углерода для автотрофов.
Большинство гетеротрофов замедляют рост в
его присутствии
Перемешивание среды Равномерное распределение компонентов по
всему объему среды в биореакторе
Вязкость среды Определяет диффузию питательных веществ и
перемешивание клеток продуцента
Оценка альтернативных путей получения продукта через
себестоимость нередко представляет собой весьма сложную задачу, так как
компоненты этой величины в различных странах и регионах в значительной
степени различаются. Себестоимость трудно определить на ранних стадиях
разработки. Поэтому оценкой эффективности биотехнологических процессов
может служить сопоставление экспериментального выхода продукта с
теоретическим выходом, рассчитанным по
материально энергетическому
балансу процесса. Это положение в первую очередь относится к
производству крупнотоннажных продуктов, так как специфика производства
биохимических реактивов и медикаментов (кроме основных антибиотиков и
некоторых других препаратов сравнительно крупномасштабного
производства) такова, что целевой продукт нередко производится в
небольших количествах и имеет высокую стоимость . При использовании
высокопродуктивных рекомбинантных продуцентов основная
доля затрат
относится к созданию и поддержанию продуцента и разработке условий его
культивирования. Экономичность использования сырья и энергоресурсов в
этих процессах играет второстепенную роль.
Контрольные вопросы
1. На чем основано математическое моделирование процесса культивирования
бактерий?
2. Кто из российских ученых является основоположником в разработке и
применении математических методов для описания
процессов
культивирования?
3. Напишите уравнение материального баланса для субстрата, биомассы и
продукта метаболизма.
4. Назовите факторы, влияющие на рост и биосинтетическую активность
продуцента.
9. НАНОБИОТЕХНОЛОГИЯ
Биотехнология главным образом известна своим применением в
медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве, но в последние
годы все большее внимание уделяется созданию новых биологических
44
материалов и машин с самыми разнообразными структурами, функциями и
назначением. Эта тенденция усилилась с приходом нанотехнологий.
Слово нанотехнология произошло от единицы измерения нанометр,
составляющей одну тысячную микрометра (10 микрона), что является
приблизительным размером молекулы. Нанотехнология – изучение,
производство и работа со сверхмалыми структурами и приспособлениями
возникла благодаря созданию микроскопических приборов.
В настоящее время
более 20 тысяч ученых по всему миру проводят
исследования в сфере нанотехнологий. Примеры потенциального
применения наноматериалов и нанотехнологий дают возможность
подсчитать, что в течение ближайших 15 лет они по всему миру позволят
создать более 2 млн рабочих мест. Сегодня много молодых компаний
работают в направлении развития нанотехнологий. На рынке наноматериалов
и их обработки
действуют более 50 компаний. Все их можно разделить на
шесть категорий: 1) обработка и получение наноматериалов;
2) нанобиотехнология;
3) программное обеспечение;
4) нанофотоника;
5) наноэлектроника;
6) наноприборостроение.
Наиболее многообещающими исследования компаний в области
нанобиотехнологий, наноэлектроники и в создании новых материалов.
Нанобиотехнология - область нанонауки и наноинженерии,
применяющей методы и подходы нанотехнологии для создания биоструктур
и
изучения биологических систем. Нанотехнологи также используют
способность биомолекул к самосборке в наноструктуры. Так, например,
липиды способны спонтанно объединяться и формировать жидкие
кристаллы. Молекулы пептидов в воде формируют правильные нановолокна,
которые, в свою очередь, связываются и образуют каркасы. ”ПюраМатрикс”
– это коммерчески реализованный каркасный материал из нановолокон,
который получил свое название благодаря
идеальности в качестве
биотехнологически разработанного биологического каркаса. Ученые биомедики во всем мире сейчас используют его для изучения раковых и
стволовых клеток и для воссоздания костной ткани. Наличие в каркасах из
нановолокон пор размером от 5 до 200 нанометров и чрезвычайно высокое
содержание воды обуславливают возможность их использования при
трехмерном выращивании клеток и тканей
в восстановительной медицине.
Помимо этого благодаря малым размерам пор этих каркасов, очевидно, их
можно будет использовать для постепенного выделения медикаментов для
пролонгирования их действия. Устройство с нанокаркасом для медленного
выделения может имплантироваться в кожу с запасом лекарства на месяцы и
даже годы.
ДНК используется не только для создания наноструктур, но
и в качестве
важного компонента наноустройств. Вполне вероятно, что ДНК,
представляющая собой молекулу, хранящую информацию, может стать
45
основным компонентом компьютеров следующего поколения. Вместо того
чтобы создавать кремниевую основу микросхемы, нанотехнологи смогут
использовать двухцепочечную молекулу ДНК, которая представляет собой
натуральный каркас для создания наноструктур, а ее способность к
высокоспецифичному связыванию позволяет объединять атомы в
предсказуемой последовательности, необходимой для создания
наноструктуры. К тому времени, как микропроцессы и микросхемы
превратятся в
нанопроцессоры и наносхемы, молекулы ДНК могут заменить
используемые в настоящее время неорганические полупроводники. Такие
биочипы будут представлять собой ДНК-процессоры, использующие
исключительную способность ДНК к хранению информации.
Другие биологические молекулы также используются для создания
способов передачи как можно большего количества информации. Например,
некоторые исследователи изучают возможность использования
поглощающих свет молекул
подобных тем, что содержатся в сетчатке глаза,
для тысячекратного увеличения объема хранящейся на компакт-дисках
информации. Применение нанобиотехнологии будет способствовать
развитию экологически чистых производственных процессов.
Исследования по практическому применению нанобиотехнологии в
медицине направлены на совершенствование средств и методов диагностики,
профилактики и лечения. К ним можно отнести:
- повышение чувствительности и
экспрессности анализа, что позволит
осуществлять раннюю диагностику заболеваний и уже в ближайшее время
может быть использовано для обнаружения онкологических, эндокринных и
сердечно - сосудистых заболеваний, вирусных и бактериальных инфекций.
Особым типом наноустройств являются биочипы, основанные на
применении полимеразной цепной реакции. Они позволяют оценить
генетический статус обследуемого пациента и/или патогенного
микроорганизма и
спланировать мероприятия по профилактике и лечению;
- повышение производительности позволяет проводить комплексное
обследование по набору диагностических критериев, что может быть
использовано для индивидуального подхода к лечению и профилактике;
- создание биосенсоров путем объединения биологического и электронного
компонентов в один миниатюрный прибор;
- разработка молекулярных детекторов на основе нанопор;
- изучение возможности получения
и применения эффективных
фармпрепаратов и вакцин в виде наночастиц;
- создание на основе наноструктур системы адресной доставки лекарств ,
позволяющей повысить специфичность и скорость доставки
функциональных молекул в клетки-мишени.
Технологии биосистем перспективны с точки зрения контролируемого
создания наноустройств различного назначения, таких как получение
биосовместимых наноматериалов, конструирование медицинских
нанороботов, создание минимальной искусственной
биосистемы, способной
самостоятельно воспроизводить саму себя и др.
46
Нанобактерии
В 1981 г. Д. Торелла и Р. Морита описали очень маленькие клетки
размером менее 300 нм - ультрамикробактерии. В следующем году М. Мак
Донелл и М. Худ обнаружили, что некоторые из них могут проходить через
фильтры размером 200 нм. Термин нанобактерии впервые ввел Р. Морита в
1988 г., однако «отцом» нанобактерий считается геолог Техасского
университета Р. Фольк, который, исследуя горные породы, расположенные
вблизи геотермальных источников в окресностях Рима в 1989г обнаружил
подобные структуры в туфе и дал им название «нанобактерии», для того
чтобы подчеркнуть их геологическую принадлежность. Начиная с 1992г. им
была опубликована серия работ по этому вопросу. Несколько лет спустя, в
1996г. доктор
К. Романек из НАСА, исследуя осколок марсианского
метеорита, упавшего в Антарктиде, обнаружил в нем структуры,
напоминающие нанобактерии. При этом размеры неизвестных частиц
составляли около 50 нм. В почвах, осадочных породах и минералах они
встречаются в значительных количествах и, очевидно, представляют
промежуточную форму жизни между бактериями и вирусами. По мнению
ученых, нанобактерии
играют важную роль в образовании минералов,
превращении вулканических пород в почву и коррозии металлов.
Проявление некоторых патологических состояний почек у человека, в
частности образование камней, исследователями из университета города
Копио (Финляндия) во главе с О. Кайяндером было объяснено наличием
Nanobacterium sanguineum. В ходе дальнейших экспериментов финским
ученым удалось получить МАт, которые связываются
с поверхностными
белками нанобактерии, присутствие которых легко определить в любой
среде, в том числе и в почечных камнях. С их помощью нанобактерии были
найдены в 90 % почечных камней у больных мочекаменной болезнью. После
введения нанобактерий кроликам и крысам у них быстро развилась
мочекаменная болезнь. В 1998 г. ученые показали, что обнаруженная ими
бактерия может реплицироваться в бактериальной среде и имеет ДНК.
Группа американских специалистов из клиники Мейо в Рочестере под
руководством доктора Д.Лиски обнаружила в органах некоторых больных
людей бактерии, обладающие странными свойствами. Изучая
кальцинированные артерии и сердечные клапаны, они обнаружили на их
стенках крошечные сферы диаметром 30 – 100 нм. Как показали
исследования, эти
наносферы выделяли некоторые аминокислоты, но какие
пока неизвестно. Эти частицы способны к самовоспроизведению, хотя
способ репликации пока неизвестен.
В табл. 4 нанобактерии сравнены по ряду свойств с другими
микроорганизмами – вирусами, прионами и типичными бактериями.
Таким образом, в настоящее время известно, что нанобактерии:
– имеют клеточное строение, включая цитоплазму, в которой
выделяются электронноплотные
участки и клеточная стенка, похожая на
клеточную стенку грамотрицательных бактерий;
– имеют исключительно малый размер, сопоставимый с размером
мельчайших вирусов;
47
– в отличие от вирусов способны размножаться как внутри
эукариотических клеток, так и в окружающей среде, в том числе на
искусственных питательных средах. Одну из первых выделенных линий
удается культивировать в течение 6 лет. Поскольку скорость роста
нанобактерий примерно в 10 000 раз меньше, чем скорость роста типичных
бактерий, смену среды проводят один раз
в месяц;
представляют промежуточную форму жизни между бактериями и вирусами.
По мнению ученых, нанобактерии играют важную роль в образовании
минералов, превращении вулканических пород в почву и коррозии металлов.
Проявление некоторых патологических состояний почек у человека, в
частности образование камней, исследователями из университета города
Копио (Финляндия) во главе с О. Кайяндером было
объяснено наличием
Nanobacterium sanguineum. В ходе дальнейших экспериментов финским
ученым удалось получить МАт, которые связываются с поверхностными
белками нанобактерии, присутствие которых легко определить в любой
среде, в том числе и в почечных камнях. С их помощью нанобактерии были
найдены в 90 % почечных камней у больных мочекаменной болезнью. После
введения нанобактерий кроликам и
крысам у них быстро развилась
мочекаменная болезнь. В 1998 г. ученые показали, что обнаруженная ими
бактерия может реплицироваться в бактериальной среде и имеет ДНК.
Группа американских специалистов из клиники Мейо в Рочестере под
руководством доктора Д. Лиски обнаружила в органах некоторых больных
людей бактерии, обладающие странными свойствами. Изучая
кальцинированные артерии и сердечные
клапаны, они обнаружили на их
стенках крошечные сферы диаметром 30 – 100 нм. Как показали
исследования, эти наносферы выделяли некоторые аминокислоты, но какие
пока неизвестно. Эти частицы способны к самовоспроизведению, хотя
способ репликации пока неизвестен. В настоящее время известно, что
нанобактерии:
– имеют клеточное строение, включая цитоплазму, в которой
выделяются электронноплотные участки и клеточная
стенка, похожая на
клеточную стенку грамотрицательных бактерий;
– имеют исключительно малый размер, сопоставимый с размером
мельчайших вирусов;
– в отличие от вирусов способны размножаться как внутри
эукариотических клеток, так и в окружающей среде, в том числе на
искусственных питательных средах. Одну из первых выделенных линий
удается культивировать в течение 6 лет. Поскольку
скорость роста
нанобактерий примерно в 10 000 раз меньше, чем скорость роста типичных
бактерий, смену среды проводят один раз в месяц;
– содержат нуклеиновую кислоту, структура которой до сих пор не
установлена, и небольшой набор специфических белков. Если геном
типичных бактерий кодирует несколько тысяч белков, то нанобактерии, по
разным данным, содержат всего от
нескольких до нескольких десятков
белков.
48
Для объяснения указанных выше особенностей нанобактерий финский
исследователь О. Кайяндер и его коллеги выдвинули следующие
предположения:
1. Нанобактерии не синтезируют собственные аминокислоты, жирные
кислоты (и, возможно, нуклеотиды), а используют готовые, получая их из
окружающей среды. При нехватке экзогенных жирных кислот мембранные
липиды могут частично заменяться фосфатом кальция.
2. У нанобактерий отсутствуют энергоемкие
системы актив- ного
транспорта, характерные для про- и эукариотических клеток. Транспорт
веществ осуществляется за счет диффузии и броуновского движения, чему
способствуют ультрамикроскопические размеры бактерии.
3. Концентрация растворенных веществ и, следовательно,
осмотическое давление внутри нанобактерий не отличается от окружающей
среды. В связи с этим нанобактериям не требуются энергозатратные системы
поддержания внутриклеточного гомеостаза
.
Несколько микробиологов уже повторили опыты О. Кайяндера и его
коллег и подтвердили существование нанобактерий. Первый из них – Д.
Колтон из университета Макгилла в Монреале. Ему удалось выделить
медленно растущие нанобактерии, которые одновременно с ростом строили
вокруг себя оболочку из кальция. Их белки оказались похожими на белки
других бактерий.
Но многие
учёные тем не менее сомневаются в том, что нанобактерии
действительно являются жизненной формой, и утверждают, что с большей
вероятностью это органические структуры, а не биологические. Д. Цисар из
Национального института здравоохранения в Бетесде (США) считает, что
недостаточно убедительных подтверждений существования нанобактерий и
наличия в них ДНК. Расчеты, выполненные Д. Манилоффым из
Рочестерского университета (штат Нью-Йорк), показали: для того чтобы
содержать ДНК и белки, необходимые клетке для обеспечения
функционирования и главное репликации, ее размер должен быть не менее
140 нм. В то же время, по данным разных ученых, большинство
нанобактерий имеют диаметр от 30 до 100 нм, т.е. в 10 раз меньший диаметр
в 1000 раз меньший объем, чем типичные бактерии.
и
Несмотря на то, что со времени первого обнаружения бактерий прошло
около 20 лет, существование нанобактерий на данное время является одним
из спорных научных вопросов, поскольку открытие этой новой формы жизни
имеет не только академическое, но и практическое значение. Исследования в
данном направлении проводятся во
многих лабораториях мира и можно
надеяться, что в ближайшее время полученные результаты позволят
разрешить возникшие вопросы.
Контрольные вопросы
1. Что такое нанобиотехнология?
2. Каковы перспективы ее применения в диагностике и лечении болезней?
3. История обнаружения нанобактерий.
4. Чем отличаются нанобактерии от типичных (обычных) бактерий, вирусов
и прионов?
49
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Данная часть курса лекций должна явиться началом цикла,
посвященного основам биотехнологии, методам, аппаратам и приборам,
используемым как в лабораторной практике, так и при промышленном
производстве различных биопрепаратов. В этой части кратко описаны
процессы «старой» классической биотехнологии и большее внимание
уделено комплексу современных методов, обеспечивающих не только
разработку новых технологий,
но и позволяющих модифицировать процессы,
известные несколько столетий. Важность освоения знаний биотехнологии
подчеркивалась неоднократно в докладах на форумах разных уровней, в
статьях, постановлениях и других документах. Углубление процесса
интеграции науки и образования способствует дальнейшему повышению
уровня подготовки кадров для проведения фундаментальных исследований в
области биотехнологии и разработки новых технологий. Создание учебно
-
научных центров и научно-образовательных комплексов на базе ведущих
научно-исследовательских институтов и вузов обеспечивает их эффективную
интеграцию. Важнейшим элементом современной системы подготовки
специалистов - биотехнологов для работы в сфере науки и производства
является опережающее образование, состоящее в постоянном глубоком
анализе новейших тенденций и направлений фундаментальной
биотехнологической науки и своевременной корректировке
образовательных
программ и учебных планов с учетом требований времени. Важным
фактором динамичного развития современного биотехнологического
образования является использование передовых информационных
технологий, создающих принципиально новые возможности в получении
современных знаний и приобретении профессиональных навыков в области
биотехнологии. Бесспорно, что прогресс биотехнологии нереален без
разработки специализированных аппаратных, алгоритмических и
программных средств, а соответствующая
отрасль кибернетики вошла в
состав биоинформатики. Для получения новых знаний необходимы
передовые информционные технологии, поскольку в результате очень
быстрого прогресса биотехнологии информация, изложенная в учебных
пособиях, очень быстро стареет и, кроме того, ни один учебник не может
вместить весь объем знаний, накопленный биотехнологией за ее
многовековую историю и особенно в
последние десятилетия.
50