Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Методы исследования молока и молочных продуктов. Учебно-методическое пособие.pdf
51
Посредством перемещения ручки происходит перемещение кювет,
что позволяет последовательно анализировать исследуемое вещество и вещество сравнения.
Фоновый световой поток корректируется при этом каналом сравне-
ния. Концентрация растворенного в исследуемой среде вещества прямо
пропорциональна оптической плотности среды.
Все световые потоки фотоприемник преобразует в соответствующие
электрические сигналы.
Микропроцессор прибора обрабатывает эти электрические сигналы и
отображает их на цифровом дисплее фотоколориметра уже в виде оптической плотности и коэффициента пропускания.
Устройство спектрофотометров отличается от фотоколориметра не-
значительно, однако принцип их действия иной.
На рис. 4.6 изображена схема однолучевого спектрофотометра.
Р и с. 4.6. Схема однолучевого спектрофотометра:
1 – источник света, 2 – линза, 3 – монохроматор, 4 – дифракционная решетка, 5 – кювета
с раствором, 6 – фотоэлемент, 7 – детектор, 8 – дисплей, отображающий показания
оптической плотности
Свет от источника 1, имеющего сплошной спектр, проходя через лин-
зу 2, фокусируется и попадает в монохроматор 3, представляющий собой
входную и выходную щели и призму, заключенную между ними, посредством которой происходит разложение падающего излучения в спектр.
За счет подвижной установки монохроматора 3 кювета с исследуемым образцом 5 последовательно освещается светом с различной длиной
волны, что позволяет проводить исследования в широком диапазоне.
Приемник излучения (фотоэлемент) 6 трансформирует энергию светового излучения в энергию электрических импульсов, усиливая сигнал за
счет применения усилительной системы.
Выходящий электрический сигнал распознается детектором 7, регистрирующее устройство которого позволяет производить отсчет и запись
сигналов.
В качестве регистрирующего устройства могут использоваться гальванометр, осциллограф, самописец и др.
Полученные результаты выводятся на дисплей 8.
Принцип работы двухлучевого спектрофотометра представлен на
рис. 4.7.
52
Р и с. 4.7. Схема двухлучевого спектрофотометра:
1 – источник излучения, 2 – входная щель, 3 – монохроматор, 4 – выходная щель, 5 – делитель излучения (модулятор), 6 – кювета с раствором сравнения, 7 – кювета с рабочим
раствором, 8 – зеркало, 9 – детектор
Процесс получения монохромного излучения осуществляется таким
же образом, как и в однолучевых спектрофотометрах.
Выделенный пучок монохроматического излучения через выходную
щель 4 поступает в оптическую систему, где оно попадает на быстро вращающийся участок зеркала – модулятор 5, разделяющий падающее излучение на маленькие порции. Так как скорость вращения модулятора очень высока, излучение разделяется постоянно.
Одна часть излучения, отражаясь от системы зеркал 8, попадает в кю-
вету, содержащую рабочий раствор 7 (рабочий луч), а вторая – на кювету с
раствором сравнения 6 (луч сравнения).
Пучки монохроматического излучения проходят параллельно через
кюветы с исследуемым раствором и раствором сравнения.
Оба луча попадают на фотоэлементы посредством отражения от зер-
кал 8, а затем на устройство сравнения (фотодетекторы) 9, где происходит
сравнение их интенсивностей.
Результат сравнения определяется и регистрируется индикатором
(блоком регистрации графическим, оптическим или цифровым).
Фотометрия нашла применение главным образом в исследованиях
пищевых продуктов на предмет загрязненности тяжелыми металлами.
Достоинствами спектральных методов исследования в целом являются: высокая чувствительность и точность методов, возможность анализировать вещества в различном агрегатном состоянии, малый объем пробы для
проведения анализа.
К недостаткам относятся: влияние структуры и химической неоднородности анализируемых материалов на результаты определения; отсутствие стабильных источников возбуждения спектров, высокую стоимость
приборов и требования к квалификации персонала.
53
Лабораторная работа 4
Определение концентрации лактозы
в молочных продуктах фотометрическим методом
Цель работы – приобретение навыков определения массовой доли лактозы
в молоке и сухих кисломолочных смесях метод фотометрии.
Метод фотометрии широко применяется для количественного анализа
минеральных веществ в пищевых продуктах, напитках, определения массовой доли лактозы в молоке и молочных продуктах, определения контаминации пищевых продуктов и сырья тяжелыми металлами.
Фотометрический метод основан на способности определяемого вещества (компонента смеси) поглощать электромагнитное излучение оптического диапазона. Для каждого вещества, поглощающего излучение, существует определенное распределение интенсивности поглощения по длинам
волн, в связи с чем определение концентрации вещества проводят при
длине волны, соответствующей максимальному поглощению. Таким образом, поглощение в данном методе исследования является количественной
характеристикой определяемого вещества и используется в качестве аналитического сигнала.
В процессе фотометрии световой поток интенсивности J
кювету с исследуемым раствором, при этом интенсивность выходящего
светового потока будет меньше исходной. Это связано с тем, что в процессе
распространения светового потока через кювету с исследуемым веществом
происходит его частичное поглощение молекулами исследуемого вещества,
частичное отражение от молекул вещества, стенок кюветы и поверхности
раствора. Этот процесс можно описать следующим уравнением (4.1):
Теоретическая часть
падает на
0
где J
J
– интенсивность падающего потока;
0
– интенсивность потока, отраженного от стенок кюветы и поверх-
n
ности раствора;
J
, – интенсивность потока, поглощаемого молекулами исследуемого
a
раствора;
J
– интенсивность потока, отражаемого от молекул исследуемого
r
раствора;
J – интенсивность потока, проходящего через раствор.
В случае прозрачных растворов величинами J
бречь, так как они очень малы.
= + + + , (4.1)
и Jr можно прене-
n
54
Ослабление интенсивности излучения описывается с помощью вели-
чины трансмиссии Т (пропускания), характеризующей ту часть излучения,
которая поглощается средой:
=
. (4.2)
Таким образом, если излучение полностью проходит через пробу, то
величина пропускания равна Т=1 (или 100%), напротив, в случае полного
поглощения света веществом Т=0.
При прохождении потока лучей через частично поглощающую среду
интенсивность прошедшего потока J будет зависеть от толщины слоя поглощающего вещества и количества молекул (концентрации). Согласно закону Бугера – Ламберта – Бера эта зависимость выражается уравнением:
log
=
, (4.3)
где J – первоначальная интенсивность излучения,
J
– интенсивность излучения после прохождения через вещество,
0
– молярный коэффициент экстинкции, имеет постоянное значение
для вещества, л/(моль∙см),
с – молярная концентрация вещества, моль/л,
d – толщина поглощающего слоя, см.
Следует учитывать, что закон Бугера – Ламберта – Бера применим
только в случае, когда ослабление интенсивности излучения происходит
только за счет абсорбции его в среде пробы, что соответствует прозрачным
растворам без помутнений либо сильно разбавленным растворам.
Отсутствие помутнений предотвратит рассеивание излучения и позволит получить более достоверные результаты. Слишком концентрированные растворы демонстрируют очень интенсивное поглощение излучения,
вследствие чего закон Бугера – Ламберта – Бера не выполняется.
Кроме того измерения следует проводить с использование монохроматического излучения, так как коэффициент экстинкции является функцией длины волны.
С учетом уравнения (4.3) уравнение (4.4) будет иметь вид
= log = log
=
, (4.4)
где D – оптическая плотность вещества.
Оптическая плотность является безразмерной величиной, которая
может принимать значения от 0 до ꝏ. Ее физический смысл заключается в
том, что при толщине слоя исследуемого вещества d =1 см и его концентрации С=1 моль/л оптическая плотность равна коэффициенту экстинкции или
молярному коэффициенту поглощения
, который соответствует углу
55
наклона прямой, описывающей зависимость оптической плотности от концентрации.
Таким образом, если соблюдены все условия при проведении анализа,
обеспечивающие получение достоверных данных, концентрацию вещества
в растворе можно рассчитать по формуле (4.5):
=
. (4.5)
Как уже упоминалось выше, закон Бугера – Ламберта – Бера справед-
лив лишь в диапазоне низких концентраций, поэтому при проведении измерений необходимо следить за тем, чтобы значение оптической плотности
находилось в пределах 0,2…1,2.
Особенностью молочных продуктов является их поликомпонентный
состав, что делает невозможным непосредственное исследование этих веществ методом фотометрии.
Определение массовой доли лактозы в молоке проводят методом Лоренса, сущность которого заключается в извлечении белков из исследуемого продукта путем растворения их гидроксидом натрия, последующем
фильтровании, добавлении к фильтрату фенола и концентрированной серной кислоты и фотометрировании образованного комплекса лактозы с фенолом на фотометре при длине волны 490 нм и черном светофильтре.
Методика проведения занятия
На первом этапе занятия проводится контроль знаний студентов по
теме работы в форме собеседования по контрольным вопросам или тестирования.
Затем студенты разбиваются на бригады по 2-3 человека. Каждая бригада готовит по одному стандартному разведению из табл. 1, после чего
определяют оптическую плотность в каждом из приготовленных растворов.
По полученным данным каждый студент строит градуировочный график.
Затем каждая бригада получает свой образец продукта и проводит его подготовку к исследованию, анализирует и с помощью градуировочного графика определяет концентрацию лактозы в нем. Определяют массовую долю
углеводов в жидкой кисломолочной смеси «Малютка».
В заключительной части занятия студенты приводят в порядок рабочие места, оформляют отчет о работе, формулируют выводы и предоставляют отчет на проверку преподавателю.
Оборудование и материалы
Для проведения занятия требуются следующие приборы: колориметр
фотоэлектрический концентрационный КФК-3 с кюветами рабочей длины
10 мм; весы лабораторные 2 класса точности с ценой деления не более
0,001 г; материалы: конические колбы вместимостью 100 см
3
и 50 см3; мер-
56
ные колбы вместимостью 100 см3; пипетки вместимостью 1 см3; 2 см3;
3
5 см
; стеклянная воронка; бумажный фильтр; цилиндр мерный на 50 см3
миллиметровая бумага.
Ход работы
Определение массовой доли лактозы в молоке и молочных продуктах
В коническую колбу вместимостью 100 см
и смешивают его с 25 см
3
дистиллированной воды. Добавляют 2 см3 1М
раствора гидроксида натрия и помещают в мерную колбу на 100 см
3
отвешивают 1 г продукта
3
, перемешивают до растворения белков и доводят объем дистиллированной водой
до метки. Раствор фильтруют через складчатый фильтр, затем 1 см
трата смешивают с 1 см
3
5% раствора фенола и 5 см3 концентрированной
3
филь-
серной кислоты. В полученной смеси определяют оптическую плотность,
используя для сравнения контрольную пробу.
В качестве контрольной пробы используют смесь 1 см
5% раствора фенола и 5 см
3
концентрированной серной кислоты. Получен-
3
воды, 1 см3
ный раствор вносят в кювету длиной 10 мм, контрольный раствор вносят в
такую же кювету. Жидкость в кювету необходимо наливать до метки на ее
боковой стенке; не следует наклонять кювету при установке в кюветодержатель. Перед каждым измерением рабочие поверхности кювет необходимо
протирать спиртоэфирной смесью. При установке кювет в кюветодержатель
нельзя касаться пальцами рабочих участков поверхностей (ниже уровня
жидкости в кювете), так как наличие загрязнений на рабочей поверхности
кюветы приводит к получению неверных результатов измерений.
Внешний вид фотометра КФК-3 представлен на рис. 4.8.
Р и с. 4.8. Внешний вид фотометра КФК-3:
1 – основание, 2 – кожух, 3 – кюветное отделение, 4 – ручка, 5 – монохроматор
Фотометр выполнен в виде одного блока. На металлическом основа-
нии 1 закреплены отдельные узлы, которые закрываются кожухом 2. Кюветное отделение закрывается съемной крышкой 3. Ввод в световой пучок
одной или другой кюветы осуществляется перемещением ручки 4 до упора
влево или вправо. При установке ручки до упора влево в световой пучок
57
вводится кювета с «холостой пробой» (растворителем или контрольным
раствором), при установке ручки до упора вправо – в световой пучок вводится кювета с исследуемым раствором. При открытой крышке кюветного
отделения шторка автоматически перекрывает световой поток. Ручка 5
служит для поворота дифракционной решетки и установки требуемой длины волны.
Принцип работы оптической системы прибора схематично изображен
на рис. 4.9.
В кюветное отделение между объективом 7, 8 и линзой 10 устанавли-
ваются прямоугольные кюветы 9.
Перед началом работы фотометр необходимо установить на рабочем
месте и следить за тем, чтобы на него не попадали прямые солнечные лучи.
Тумблер «СЕТЬ» установить в выключенном положении. Закрыть крышку
кюветного отделения. Подсоединить фотометр к сети 220 В, 50 Гц. Включить тумблер «СЕТЬ». Для установления рабочего режима и обеспечения
стабильной работы фотометр необходимо выдержать не менее 30 минут с
момента включения.
Р и с. 4.9. Оптическая (принципиальная) схема фотометра КФК-3:
1 – лампа, 2 – конденсор, 3 – светофильтр, 4 – дифракционная решетка, 5 – вогнутое зеркало, 6 – поворотное зеркало, 7, 8 – линзы объектива, 9 – кювета с исследуемым вещест вом, 10 – фокусирующая линза, 11 – приемник, D1, D2 – щелевые диафрагмы
Подготовка фотометра к работе осуществляется в автоматическом
режиме: на индикаторе отображается символ завода-изготовителя «ОАО
«ЗОМЗ», сообщение «ПРОГРЕВ ПРИБОРА» и показания таймера; по истечении 2,5 мин на индикаторе отображается надпись – шифр фотометра
«КФК-3-01»; по истечении 5 мин автоматически учитывается «нулевой отсчет», включается источник излучения; на индикаторе отображается значение длины волны в нм, надпись «ПРОГРЕВ ЛАМПЫ» и показания таймера;
по истечении 10 мин фотометр выдает звуковой сигнал готовности к работе
58
и на индикаторе отображается надпись «ГОТОВ К РАБОТЕ. ВВЕДИТЕ
РЕЖИМ».
При работе в диапазоне длин волн 315–450 нм перед измерениями
фотометр необходимо выдерживать не менее 5 минут при закрытой крышке
кюветного отделения.
Фотометр готов к работе.
Измерение оптической плотности
1. Ручкой установки длин волн 5 (рис. 4.8) установить необходимую
длину волны. Значение длины волны отображается на дисплее.
2. Установить в кюветное отделение кюветы с «холостой пробой» и
исследуемым раствором. Кювету с «холостой пробой» установить в дальнее
гнездо кюветодержателя, а кювету с исследуемым раствором – в ближнее
гнездо.
3. Ручку перемещения кювет (4) вытянуть максимально на себя, при
этом в световой пучок вводится кювета с «холостой пробой». Закрыть
крышку кюветного отделения.
4. Клавишей выбора режима «D» выбрать режим измерения «А – ОПТИЧЕСКАЯ ПЛОТНОСТЬ». Нажать клавишу «#». На индикаторе должно
отобразиться «ГРАДУИРОВКА», через 3–5 с данная надпись исчезает и
вместо нее отображается «А =0,000 ± 0,002». Если значение «0,000» отобразилось с большим отклонением, повторно нажать клавишу «#».
5. Ручку перемещения кювет 4 переместить во внутрь прибора до
упора. При этом в световой пучок вводится кювета с исследуемым раствором. На индикаторе отображается значение коэффициента оптической
плотности исследуемого раствора.
Операции по пп. 2–5 повторить три раза. Значение коэффициента
пропускания (оптической плотности) исследуемого раствора определяется
как среднее арифметическое из полученных отсчетов.
Для того, чтобы перейти от выходного сигнала фотометра – оптической плотности – к определяемой концентрации, необходимо произвести
построение градуировочного графика.
Чтобы получить данные для построения графика, из 2%-ного раствора
лактозы готовят 0,2%-ный раствор.
Для этого в мерную колбу вместимостью 200 cм
3
вносят 20 см3
2%-ного раствора лактозы и доводят объем дистиллированной водой до
метки, а из полученного раствора (реактив) готовят следующие разведения
(табл. 4.7).
Для фотометрирования берут 1 см
3
фенола и с 5 см3 концентрированной серной кислоты.
1см
3
каждого разведения, смешивают с
Определяют оптическую плотность и строят градуировочный график,
отражающий зависимость оптической плотности раствора от концентрации
лактозы в нем.
59
В табл. 4.3 приведены данные о концентрации лактозы и объеме раз-
Объем, см 3
Концентрация лактозы в
разведении, мкг/см3
Реактив
Дистиллированная вода
1
99 1 2
98 2 3
97 3 4
96 4 5
95 5 10
90
10
15
85
15
20
80
20
25
75
25
30
70
30
35
65
35
40
60
40
ведения для приготовления рабочих растворов, используемых для построения градуировочного графика.
Таблица 4.3 – Концентрация лактозы и объем разведения для приготовления ра-
бочих растворов
Массовую долю лактозы в продукте рассчитывают по градуировоч-
ному графику, затем делают пересчет на 100 г продукта по формуле (4.6):
=
, (4.6)
где Л – массовая доля лактозы в исследуемом растворе, %;
С – концентрация лактозы в растворе для анализа по градуировочному
графику моль/дм
3
.
Определение массовой доли углеводов в жидкой кисломолочной смеси
«Малютка»
В стеклянную пробирку пипеткой отмеривают 0,5 см
ванной воды и 7,5 см
3
10 М раствора серной кислоты. Хорошо перемеши-
3
дистиллиро-
вают, выдерживают на кипящей водяной бане в течение 20 мин, охлаждают
до температуры 20°С. Полученный раствор используют в качестве холостой
пробы.
В стакане вместимостью 50 см
3
взвешивают 10 г продукта. Навеску
растирают стеклянной палочкой с небольшим количеством дистиллированной воды температурой 40–50°С и переливают в мерную колбу вместимостью 100 см
Для осаждения белков в колбу приливают по 0,5 см
3
. Стакан ополаскивают водой, которую затем сливают в колбу.
3
растворов ацетата цин-
ка и гексацианоферрата (II) калия. После внесения каждого раствора смесь
перемешивают.
Содержимое колбы доливают до метки водой, перемешивают и спу-
стя 5 мин фильтруют через сухой складчатый фильтр в сухую колбу.
60
В стеклянную пробирку пипеткой отмеривают 0,5 см3 фильтрата,
1 2 3 4 5 10 15 20 25 30 35 40
3
7,5 см
10 М серной кислоты. Хорошо перемешивают, выдерживают на ки-
пящей водяной бане в течение 20 мин, охлаждают до температуры 20°С и
фотометрируют, используя кювету с длиной оптического пути 10 мм.
На фотометре с синим фильтром λ=(450±10) нм измеряют оптическую
плотность (D) исследуемого раствора относительно холостой пробы, отсчитывают показания.
Массовую долю углеводов Х (%) вычисляют по формуле:
=
2 0,8. (4.7)
,
Расхождения между параллельными определениями массовой доли
углеводов не должны превышать 0,5%.
Определение массовой доли углеводов в молоке
В коническую колбу на 100 см
смешивают его с 25 см
3
дистиллированной воды. Добавляют 2 см3 1М рас-
твора гидроксида натрия и помещают в мерную колбу на 100 см
3
отвешивают 1 г продукта (молока) и
3
, перемешивают до растворения белков и доводят объем дистиллированной водой
до метки. Раствор фильтруют через складчатый фильтр. 1 см
фильтрата смешивают с 1 см
3
5% раствора фенола и 5 см3 концентрирован-
3
полученного
ной серной кислоты. В полученном растворе определяют оптическую плотность, используя для сравнения холостую пробу.
В качестве холостой пробы используют смесь 1 см
фенола и 5 см
3
концентрированной серной кислоты.
3
воды, 1 см3 5%
Массовую долю лактозы в молоке определяют по градуировочному
графику.
Результаты работы
Данные для построения градуировочного графика и значения оптиче-
ских плотностей каждого из рабочих растворов заносят в табл. 4.4.
Таблица 4.4 – Данные для построения градуировочного графика
Концентрация лактозы в разведении, мкг/см3 Оптическая плотность, D