Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Клональное разнообразие и механизмы его формирования у однополых видов ящериц рода Darevskia. Монография
.pdf
Ê
ЛОНАЛЬНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И МЕХАНИЗМЫ ЕГО ФОРМИРОВАНИЯ У ЯЩЕРИЦ РОДА
Darevskia
единого клона у этого вида, и позволили по иному взглянуть на
его популяционную структуру. Оставалось неясным, отражают
ли эти результаты события, связанные с начальными этапами
внутривидовой дифференциации D. rostombekowi, или сценариями гибридного происхождения партеновида.
Новая информация для разрешения этих вопросов была по-
лучена благодаря новому подходу для генетипирования, с использованием
для этого клонированных локусов ядерного генома, содержащих микросателлитные ДНК [Vergun et al., 2014].
И первым шагом в этом направлении явилось выявление аллельных вариантов локусов, содержащих микросателлитные ДНК,
у партеновида D. rostombekowi. Для этого был проведен анализ
аллельного полиморфизма трёх микросателлитсодержащих
локусов (Du215, Du281, Du323) в популяциях D. rostombekowi
(42 особи, из 4-х популяций Армении) с помощью монолокусной ПЦР (с последующим клонированием и секвенированием
продуктов амплификации) [Осипов и др., 2014].
В таблице 4 показано, что аллельные варианты локусов отличаются по структуре микросателлитов и по однонуклеотидным
вариациям — SNVs, расположенным на фиксированных
расстояниях от микросателлитного кластера и образующих различные сочетания
— гаплотипы, характерные для определенных
аллелей.
Как видно из таблицы 5, Аллель Du215/5 равномерно распределен во всех четырех популяциях и обнаружен у всех особей.
Аллель Du215/2 обнаружен в трех популяциях, причем в одной
из популяций (Гош) — только у половины особей. Остальные
аллели (Du215/1, 3, 4) оказались редкими и встречались только
в двух популяциях — у половины особей наиболее полиморфной популяции
Гош и у всех особей наименее полиморфной
популяции Загалу.
Среди аллелей локуса Du281, три широко представлены во
всех или большинстве популяций (Du281/1, 2, 4) и обнаружены
у всех или части особей. Один аллель (Du281/3) оказался редким и обнаружен у всех особей популяции Загалу. Mономорфный локус Du323 во всех популяциях представлен двумя аллелями у всех
D. rostombekowi,
особей.
как и все партеногенетически
размножающиеся виды рода Darevskia, имеет гибридное происхождение; материнским считается вид D. raddei, а отцовским — D. portschinskii
g 51 G
Таблица 4
И DU323 ПАРТЕНОГЕНЕТИЧЕСКОГО ВИДА D. rostombekowi
À.À. Â
ANK
№
B
.
AC
ENE
G
*
ЗАМЕНЫ НА ФЛАНГАХ
ИКСИРОВАННЫЕ НУКЛЕОТИДНЫЕ
Ф
ОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
П
МИКРОСАТЕЛЛИТНОГО КЛАСТЕРА
ЕРГУН
3’ −− GU972528
11
(GCAA)
10
, À.Å. Ã
3’ −− GU972529
11
(GCAA)
9
3’ TT (–98/99) GU972530
10
(GCAA)
9
ИРНЫК
3’ −− GU972531
11
(GCAA)
8
, Ô.À. Î
3’ −− GU972532
2
(GCAA)
7
(GAT)(GATA)
4
3’ T (–84), A (–19), T (+15), A (+25) HM114225
12
(GAT)(GATA)
11
(GAGAT)(GATA)
2
3’ T (–84), A (–19), T (+15), A (+25) HM070256
12
(GAT)(GATA)
10
(GAGAT)(GATA)
2
СИПОВ
T (–84), A (–19), T (+15), A (+25) HM070257
3’
9
(GAT)(GATA)
11
(GAGAT)(GATA)
2
, À.Â. Î
3’ C (–23), T (+39) HM013995
2
(GAT)(GATA)
6
3’ C (–84), G (–19), C (+15), G (+25) HM070258
10
...(GATA)
6
МЕЛЬЧЕНКО
(GAT)(GATA)3’ A (–23), C (+39) HM013996
3
…(GATA) (GGT)(GATA)
4
ТРУКТУРНЫЕ РАЗЛИЧИЯ АЛЛЕЛЕЙ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ DU215, DU281
С
.)
П
.
ЛИНА
Н
(
Д
ЛЛЕЛЬ
А
Du215(rost)1 256 5’ (GATA)
Du215(rost)2 252 5’ (GATA)
Du215(rost)3 250 5’ (GATA)
Du215(rost)4 248 5’ (GATA)
Du215(rost)5 227 5’ (GATA)
Du281(rost)1 265 5’ (GATA)
Du281(rost)2 261 5’ (GATA)
Du281(rost)3 253 5’ (GATA)
Du281(rost)4 191 5’ (GATA)
Du323(rost)1 195 5’(AC)
Du323(rost)2 184 5’(AC)
Даны расстояния в нуклеотидных парах (н.п.) до (–) и после (+) микросателлитного кластера
*
g 52 G
Ê
ЛОНАЛЬНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И МЕХАНИЗМЫ ЕГО ФОРМИРОВАНИЯ У ЯЩЕРИЦ РОДА
Darevskia
[Moritz et al., 1992]. Следовательно, аллельные варианты изученных локусов у D. rostombekowi были наследованы от соответствующих родительских видов. Для установления, какие из этих
аллелей имеют отцовское, а какие — материнское происхождение, был проведен ПЦР-анализ гомеологичных локусов у родительских видов (65 особей из 13-ти популяций D. raddei и 27 особей из двух популяций D. portschinskii). Полученные
ПЦР-
продукты были клонированы и секвенированы [Осипов и др.,
2014].
Таблица 5
В
СТРЕЧАЕМОСТЬ АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ЛОКУСОВ DU215, DU281
И DU323 В ПОПУЛЯЦИЯХ ПАРТЕНОВИДА D. rostombekowi
(N — ЧИСЛО ОСОБЕЙ)
Аллели
Du215(rost)1 1 — — —
Du215(rost)2 2 — 21 9
Du215(rost)3 1 — — —
Du215(rost)4 — 8 — —
Du215(rost)5 4 8 21 9
Du281(rost)1 3 — 14 8
Du281(rost)2 1 — 7 1
Du281(rost)3 — 8 — —
Du281(rost)4 4 8 21 9
Du323(rost)1 4 8 21 9
Du323(rost)2 4 8 21 9
Число аллельных вариантов
Гош (n=4) Загалу (n=8) Папанино (n=21) Спитак (n=9)
9 6 7 7
Популяции
В таблице 6 даны нуклеотидные последовательности разли-
чающихся участков аллелей трех гомеологичных локусов
особей родительских видов. Видно, что аллели двуполых видов
весьма разнообразны по структуре микросателлитов и также,
в случае локусов Du281 и Du323, содержат однонуклеотидные
вариации вне микросателлитов. По сочетанию этих вариаций
g 53 G
Таблица 6
À.À. Â
ЕРГУН
, À.Å. Ã
ИРНЫК
, Ô.À. Î
СИПОВ
, À.Â. Î
МЕЛЬЧЕНКО
*
—
—
ЗАМЕНЫ НА ФЛАНГАХ
ИКСИРОВАННЫЕ НУКЛЕОТИДНЫЕ
Ф
3’ T (–84), A (–19), T (+15), A (+25)
4
(GATA)
3
3’ —
3’ —
2
(GCAA)
8
КЛАСТЕРА
3’ —
3’ —
2
2
2
(GCAA)
(GCAA)
(GCAA)
6
4
5
3’
3’
3’ —
12
12
12
(GACA)
4
3’ T (–84), A (–19), T (+15), A (+25)
8
3’ —
10
(GAT)(GATA) 3’ A (–23), C (+39)
(GAT)(GATA) 3’ A (–23), T (+39)
3
2
3’ C (–23), T (+39)
3’ C (–23), T (+39)
2
2
3’ C (–23), T (+39)
2
GAT(GATA)
GAT(GATA)
GAT(GATA)
11
10
8
ДВУПОЛЫХ ВИДОВ D. RADDEI И D. PORTSCHINSKII
ТРУКТУРНЫЕ РАЗЛИЧИЯ АЛЛЕЛЕЙ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ DU215, DU281 И DU323
С
(GCAA)
GAT(GATA)
GAT(GATA)
4
4
ОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ МИКРОСАТЕЛЛИТНОГО
П
.)
П
.
Н
(
ЛИНА
(GCAA)
GAT(GATA)
GAT(GATA)
4
4
12
(GCAA)
(GCAA)
11
9
11
(GAT)(GATA) 3’ T (–84), A (–19), T (+15), A (+25)
3’ C (–84), G (–19), C (+15), G (+25)
(GAT)(GATA)
(GAGAT)(GATA)
7
2
11
3’ C (–84), G (–19), C (+15), G (+25)
(GAT)(GATA) 3’ T (–84), A (–19), T (+15), A (+25)
8
3’ C (–84), G (–19), C (+15), G (+25)
11
3’ C (–84), G (–19), C (+15), G (+25)
10
9
8
GC...(GATA)(GGT)(GATA)
GC...(GATA)(GGT)(GATA)
...(GATA)
...(GATA)
4
4
...(GATA)
6
6
6
Д
ЛЛЕЛЬ
А
Du215(rad)1 231 5’(GATA)
Du215(rad)2 223 5’ (GATA)
Du215(rad)3 219 5’(GATA)
Du215(rad)4 215 5’ (GATA)
Du215(port)1 268 5’(GATA)
Du215(port)2 264 5’ (GATA)
Du281(rad)1 220 5’ (GATA)
Du281(rad)2 214 5’ (GATA)
Du281(rad)3 208 5’ (GATA)
Du215(port)3 256 5’ (GATA)
Du215(port)4 256 5’ (GATA)
Du281(rad)4 196 5’ (GATA)
Du281(port)1 195 5’ (GATA)
Du281(port)2 191 5’ (GATA)
Du323(rad)1 184 5’ (AC)
Du281(port)3 187 5’ (GATA)
Du323(rad)2 180 5’ (AC)
Du281(port)4 183 5’ (GATA)
Du323(port)1 215 5’ (AC)
Du323(port)2 211 5’ (AC)
Du323(port)3 203 5’ (AC)
Даны расстояния в нуклеотидных парах (н.п.) до (–) и после (+) микросателлитного кластера
*
g 54 G
Ê
ЛОНАЛЬНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И МЕХАНИЗМЫ ЕГО ФОРМИРОВАНИЯ У ЯЩЕРИЦ РОДА
Darevskia
и специфической структуре микросателлита можно определить,
от какого родительского вида унаследован тот или иной аллель
каждого локуса у партеновида. Так, в локусе Du323 партеновида, аллели с гаплотипом С-Т наследованы от отцовского вида
D. portschinskii, а аллели с гаплотипом А-С — от материнского
вида D. raddei. В локусе Du281 партеновида аллели с гаплотипом
C-G-C-G наследованы от отцовского, а аллели с гаплотипом
Т-А-Т-А — от материнского вида. В случае локуса Du215 не
было выявлено родительских аллелей с дупликацией ТТ вне
микросателлита. В связи с отсутствием однонуклеотидных маркеров по этому локусу определить наследование аллелей затруднительно. Исходя из специфической структуры микросателлитных кластеров, можно
предположить, что аллели Du215 1-4 партеновида, имеющие простой тип микросателлита, наследованы
от D. portschinskii, а аллель Du215/5, обладающий более сложной структурой микросателлитного кластера, — от D. raddei.
Таким образом, большинство аллелей партеновида (за исключением Du215/3) было выявлено у родительских видов и установлено их происхождение.
Для изучения генотипического разнообразия все аллельные
варианты локусов Du215, Du281 и Du323, выявленные
у 42-х
особей D. rostombekowi, были скомбинированы и распределены
по пяти генотипам, различающимся по частоте и географическому распространению (табл. 7) [Осипов и др., 2014]. Предполагается, что особи с идентичными генотипами представляют
отдельные клональные линии. Наиболее распространенным является генотип 1, встречающийся у 24 особей (57,1%) из трех
популяций. Генотипы 2 (8 особей — 19%) и 3 (8 особей — 19%)
представлены в
двух и одной популяциях соответственно. Редкие
генотипы 4 и 5 представлены у одной особи для каждого (по
2,38%). Генотипическое разнообразие в четырех популяциях
варьирует от 0% до 75% (в среднем 11,9%). Наибольший уровень генотипического разнообразия был выявлен в популяции
Гош (несмотря на небольшую выборку), в которой также были
обнаружены редкие генотипы 4 и 5. Наименьший уровень генотипического разнообразия встречается в популяции Загалу:
здесь обнаружен только генотип 3. Популяция Загалу, таким
образом, отличается от всех популяций северной Армении.
g 55 G
À.À. Â
ЕРГУН
, À.Å. Ã
ИРНЫК
, Ô.À. Î
СИПОВ
, À.Â. Î
МЕЛЬЧЕНКО
Данные различия этой популяции могут объясняться ее изолированностью.
Таблица 7
Количест-
(частота
во особей
генотипа)
Спитак
Популяция
но
Папани-
лу
Зага-
Гош
генотипа
ЕНОТИПИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ПОПУЛЯЦИЙ D. rostombekowi
Г
Аллельная структура
Общее количество особей 4 8 21 9 42
Разнообразие генотипов (%) 3(75.0) 1(0) 2(9.5) 2(22.2) 5 (11.9)
1 Du215(2+5)+Du281(1+4)+Du323(1+2) 2 0 14 8 24 (0.571)
2 Du215(2+5)+Du281(2+4)+Du323(1+2) 0 0 7 1 8 (0.19)
3 Du215(4+5)+Du281(3+4)+Du323(1+2) 0 8 0 0 8 (0.19)
4 Du215(1+5)+Du281(1+4)+Du323(1+2) 1 0 0 0 1 (0.0238)
Генотип
5 Du215(3+5)+Du281(2+4)+Du323(1+2) 1 0 0 0 1 (0.0238)
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о муль-
тиклональности
партеногенетического вида
D. rostombekowi,
в отличие от ранее предложеной моноклональности, основанной на аллозимном анализе [Osipov et al., 2016]. Дальнейшие
исследования с применением генотип-специфических маркеров
g 56 G
Ê
ЛОНАЛЬНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И МЕХАНИЗМЫ ЕГО ФОРМИРОВАНИЯ У ЯЩЕРИЦ РОДА
Darevskia
позволят выявить, является ли клональное разнообразие результатом одного или нескольких актов межвидовой гибридизаций,
как это было показано ранее у партеногенетического вида D. dah-
li [Vergun et al., 2014].
7.3. КЛОНАЛЬНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ D. UNISEXUALIS
Darevskia unisexualis [Darevsky, 1966], как и все партеногенетические виды рода Darevskia, возник в результате межвидовой гибридизации. Родоначальными видами считаются бисексуальные виды D. raddei и D. valentini [Даревский, 1993]. Цитогенетические исследования D. unisexualis показали, что хромосомы
у этого вида акроцентрические и число их в диплоидном наборе
равно 38, включая пару микрохромосом. У D. unisexualis присутствует редуцированная половая
— w хромосома [Куприянова, 1999].
Вид D. unisexualis распространен в горных районах центральной Армении и прилегающих областях северо-восточной Турции на высоте 1700–2100 метров (рис. 10).
D. unisexualis обычно населяет коренную подстилающую породу, в основном вулканического происхождения, каменистые
осыпи, кучи камней и большие фрагменты лавы в степях вокруг гор, в местах ныне исчезнувших горных лесов, камнях на
берегу горных прудов [Darevsky et al., 1985]. Скальные ящерицы
хромосома продвинутого типа
Рис. 10. Ареал партеногенетического
вида Darevskia unisexualis на территории Армении.
Кружками и цифрами обозначены
места обитания:
1 — Кучак; 2 —
Такярлу; 3 — Лчап;
4 — Норадуз; 5 —
Загалу (Цовак)
g 57 G
À.À. Â
ЕРГУН
, À.Å. Ã
ИРНЫК
, Ô.À. Î
СИПОВ
, À.Â. Î
МЕЛЬЧЕНКО
этого вида отличаются приостренной, значительно приплюснутой головой, позволяющей проникать во всевозможные трещины и щели. Окраска верхней стороны тела скальных ящериц буроватого цвета, обычно с характерным темным рисунком из темных боковых лент и более или менее явственной полосы вдоль
хребта, состоящей из многочисленных пятен и крапинок неправильной
формы. Окраска нижней стороны тела D. unisexualis
варьирует от желто-зеленого до матово-белого цвета. По бокам
в один или два ряда вдоль всего тела расположены синие, голубые или фиолетовые пятнышки [Банников,1969].
Исследования митохондриальной ДНК с помощью рестрикционного анализа продемонстрировали очень низкий уровень
нуклеотидной изменчивости как у партеногенетического вида
в целом, так и у предполагаемого материнского предка [Moritz
et al., 1992]. Степень дивергенции митохондриального генома
между особями материнского бисексуального вида и партеногенетического вида позволяет определить возраст однополого вида, который по приблизительным оценкам составляет 5000 лет.
Аллозимный анализ трех популяций ящериц D. unisexualis показал, что 21 из 36 аллозимных локусов были константно гомозиготны, 14 показывали
фиксированную гетерозиготность
и лишь один локус был вариабелен (два аллозимных варианта)
[MacCulloch et al., 1997].
Ранее с помощью ДНК-фингерпринтинга у D. unisexualis по
некоторым микросателлитным маркерам был выявлен высокий
уровень внутривидового полиморфизма. Фингерпринтные фенотипы потомков и матерей были идентичны при анализе с пробой
М13, однако, при использовании (TCT)
и (TCC)50 была обнару-
5
жена внутрисемейная вариабельность во всех семьях [Рысков
и др., 2003]. Высокая частота мутаций этих локусов коррелирует
высокой полиморфностью популяционных фингерпринтов
с
с этими полипиримидиновыми пробами [Рысков и др., 2000].
ДНК-фингерпринтный анализ 25 семей D. unisexualis (более 84
потомков) с использованием пробы (GATA)
демонстрировал
4
мутантный фингерпринтный фенотип у 13 потомков, отличающихся от их матерей по нескольким рестриктным фрагментам
[Токарская и др., 2003]. Мутантные фенотипы,
ДНК
обнару-
женные в семьях, также были обнаружены в популяционных
g 58 G
Ê
ЛОНАЛЬНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И МЕХАНИЗМЫ ЕГО ФОРМИРОВАНИЯ У ЯЩЕРИЦ РОДА
Darevskia
образцах [Tokarskaya et al., 2004]. Расчёт частоты мутаций
(GATA)n-микросателлитов у данных ящериц показал, что она
такая же, как у некоторых двуполых видов и составляет 15% на
потомка или 0,95% на паттерн.
Использование ПЦР-анализа позволило выявить и проанализировать структуру высокополиморфных локусов, содержащих (GATA)
sexualis
[Корчагин и др. 2004а; Korchagin et al., 2007]. Только
по локусу Du281 были обнаружены
-микросателлит в популяциях и семьях
n
de novo
мутации (было
проанализировано 49 семей, 168 потомков первого поколения). Подсчитанная частота мутаций равнялась 1,428×10
D. uni-
-1
со-
бытий на зародышевую ткань [Badaeva et al., 2008]. Ранее
среди 65 проанализированных особей было найдено шесть
аллельных вариантов для Du281 локуса и только три для
Du215 локуса [Korchagin et al., 2007]. Данные по частоте мутаций локуса Du281соотносятся с частотой мутаций, полученной ранее по результатам ДНК фингерпринтного анализа
в семьях
D. unisexualis,
томка при использовании (GATA)
она равнялась 0.9×10
микросателлитной пробы
n
-2
на полосу/на по-
[Tokarskaya et al., 2004]. Определенная частота мутаций на
порядок превышает значения, полученные для индивидуальных микросателлитсодержащих локусов у бисексуальных ви-
(от 10-2 до 10-4 на локус/на гамету) [Brohede et al., 2002
дов
Ellegren 2000b; Gardner et al., 2000; Weberand Wong, 1993
Например, частота мутаций при анализе микросателлитных
локусов в родословных человека варьировала от 3×10
-4
6×10
[Ellegren, 2000b].
-3
].
до
В настоящее время на основе данных о молекулярной структуре аллелей трех локусов ядерного генома D. unisexualis, содержащих микросателлитные ДНК, получены новые результаты
по клональному разнообразию партеновида, распределению клонов в популяциях и их возможном происхождении. Был проведен анализ аллельного полиморфизма трёх (GATA)
микроса-
n
теллитных локусов (Du215, Du281, Du323) в популяциях D. unisexualis (68 особей, 5 популяций Армении) с помощью моноло-
кусной ПЦР (с последующим клонированием и секвенированием продуктов амплификации). Показано, что все исследован-
особи гетерозиготны по исследуемым локусам, а также
ные
;
,
g 59 G
À.À. Â
ЕРГУН
, À.Å. Ã
ИРНЫК
, Ô.À. Î
СИПОВ
, À.Â. Î
МЕЛЬЧЕНКО
что изучаемые локусы (за исключением локуса Du323) являются
полиморфными и представлены в популяциях несколькими аллельными вариантами. Аллельные варинты отличаются друг от
друга не только структурой и составом микросателлитного кластера, но и различным количеством однонуклеотидных вариаций — SNVs, расположенных на фиксированных расстояниях
от кластера и образующих различные сочетания — гаплотипы,
характерные для определенных
аллелей (табл. 8).
Локус Du323 является мономорфным и представлен в популяциях двумя аллелями. Аллель Du323/1 имеет C-C-T гаплотип
и микросателлитный кластер, состоящий из двух типов повторов: динуклеотидного (AC)
и сложноорганизованного (GATA)n
6
микросателлита. Аллель Du323/2 несет в своем составе гаплотип
A-C-T, динуклеотидный повтор (AC)
и (GATA)n кластер, состоя-
n
щий из совершенных и несовершенных звеньев. Таким образом,
аллели локуса Du323 отличаются не только однонуклеотидными
заменами на фиксированных позициях в последовательностях,
фланкирующих микросателлит, но и структурой самого микросателлитного кластера.
Локус Du215 является полиморфным — в популяциях было
выявлено три аллельных варианта, которые можно разделить на
группы согласно однонуклеотидным заменам, в
регионах окружающих микросателлит. Аллель 1 имеет гаплотип A-A-A-C-C,
аллели 2 и 3 — гаплотип T-A-G-C-C. При этом, аллели 2 и 3 отличаются друг от друга на одно GATA звено и характеризуются
более простой (по сравнению с аллелем 1) структурой микросателлитного кластера (табл. 8). Популяции D. unisexualis различаются по распределению аллелей, причем аллель 2 является
характерным для популяции Такярлу и не
встречается ни в од-
ной из других исследованных популяций.
Наиболее полиморфным является локус Du281 — в пяти
исследованных популяциях D. unisexualis он представлен 6-ю
аллельными вариантами. По SNVs все аллели можно разделить
на две группы, согласно их гаплотипу: к первому гаплотипу TA-T относятся аллели 1, 2, 3 и 5, второй гаплотип C-G-C объединяет аллели 4 и 6. Микросателлитный кластер является сложноорганизованным
и представлен как совершенными (GATA)n,
так и несовершенными (GAT; GATATA) повторами. Аллели
с одинаковым набором SNVs (гаплотипом) отличаются только
g 60 G
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]