Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Клональное разнообразие и механизмы его формирования у однополых видов ящериц рода Darevskia. Монография

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

07.09.2026

Размер:

2 Мб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 23 / 103 4 5 6 7 8 9 10 > Следующая >>>

ЛОНАЛЬНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И МЕХАНИЗМЫ ЕГО ФОРМИРОВАНИЯ У ЯЩЕРИЦ РОДА

Darevskia

6.2. МИКРОСАТЕЛЛИТНЫЕ ЛОКУСЫ

Небольшие размеры микросателлитных локусов позволяют применять метод полимеразной цепной реакции для генотипирования и обеспечить высокую воспроизводимость результатов [Weber, Wong, 1993]. Для типирования микросателлитов требуется небольшое количество ДНК, которую можно экстрагировать даже из сильно деградировавшего материала. Значительный полиморфизм микросателлитов и высокие темпы мутирования в этих локусах приводят к накоплению специфических мутаций, что позволяет проводить детальный анализ популяционной структуры разных видов животных Микросателлиты, в целом, более селективно нейтральны (не влияют на приспособленность особей и не вовлечены в адаптивные процессы), чем белковые маркеры, поскольку в популяционные исследования, в основном, вовлекаются STR-локусы, локализованные в интронах и других некодирующих участках геномов [Zhivotovsky et al., 2003].

В монолокусном анализе микросателлитов ядерные маркеры наследуются кодоминантно. Это означает, куса возможно определить, является ли анализируемая особь гетерозиготой или гомозиготой по данному локусу. Праймеры подбираются на участки, фланкирующие микросателлит, следовательно, амплифицируется и анализируется сам микросателлит. Поскольку фланкирующие последовательности отличаются для разных локусов, то каждая пара праймеров определяет только один определенный локус. Критическая точка для популяционной структуры — скорость мутаций микросателлитов

, которая обычно на 1–2 порядка выше, чем у аллозимов Высокая мутабильность и варьирование числа повторов могут приводить к гомоплазиям (когда одинаковые аллели возникают в результате разных мутаций из-за высокой мутабильности при некотором ограниченном числе аллельных состояний) и переоценке генетической дивергенции популяций [Hedrick, 1999]. Монолокусный анализ микросателлитов лучше всего подходит для внутривидовых исследований, межвидовой уровень практически исключен из рассмотрения. Еще одним недостатком этого метода является невозможность визуально (без последующего секвенирования) отличить аллельные варианты, одинаковые по длине, но отличающиеся между собой одной или несколькими

популяционно-

что для каждого ло-

анализа

уже

g 21 G

À.À. Â

ЕРГУН

, À.Å. Ã

ИРНЫК

, Ô.À. Î

СИПОВ

, À.Â. Î

МЕЛЬЧЕНКО

нуклеотидными заменами. Однонуклеотидный полиморфизм (SNPs) связан с высокой частотой замен, что приводит к появлению различных вариантов аллелей в популяции [Wang et al., 1993]. Неоспоримым преимуществом локус-специфического ана-

лиза является то, что с помощью этого метода можно амплифицировать и анализировать любой интересующий участок генома.

Для понимания природы мутационных изменений, происхо-

дящих в геномах

партеногенетических видов, необходимо выделение и изучение индивидуальных микросателлитсодержащих локусов. Ранее была получена клонотека геномной ДНК ногенетической ящерицы

D. unisexualis

и отобраны клоны,

парте-

содержащие различные типы микросателлитов [Корчагин и др., 2004; Корчагин и др., 2004а]. Поиск ортологичных локусов у представителей однополых и двуполых видов ящериц рода Darevskia с помощью локус-специфической ПЦР позволит выявить аллельные варианты этих локусов, установить их молекулярную структуру, а также проанализировать эволюционные отношения между видами рода Darevskia.

6.2.1. М

ОЛЕКУЛЯРНАЯ ПРИРОДА МИКРОСАТЕЛЛИТОВ

Микросателлиты — это рассеянные по геному тандемно орга-

низованные

повторяющегося звена составляет 1–6 пар нуклеотидов,

мер

число повторов — около 60. Изучение мутационных процессов

гипервариабельные последовательности ДНК

; раз-

в различных микросателлитных локусах показало, что частота мутаций в микросателлитах в зависимости от локуса варьирует от 1.210

-4

до 1.510

-2

[

Jin et al., 1996]. Интерес к микросател-

литам и механизмам, приводящим к повышенной нестабильности этих локусов, связан также с изучением различных наследственных заболеваний, например таких, как синдром фрагильной Х-хромосомы, хорея Гентингтона, спиноцеребральная атаксия, миодистрофия Дюшена и др.

В соответствии с общепринятой классификацией [Neff et al.,

2001], микросателлиты можно различать на основании типа мономерных

звеньев в микросателлитном кластере:

1) совершенные микросателлиты — микросателлиты, у ко-

торых на всем протяжении кластера одно и то же микросателлитное звено;

g 22 G

ЛОНАЛЬНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И МЕХАНИЗМЫ ЕГО ФОРМИРОВАНИЯ У ЯЩЕРИЦ РОДА

несовершенные микросателлиты — микросателлиты

Darevskia

, у которых кластер перерывается другим и/или другими микросателлитными звеньями и/или произвольными нуклеотидными последовательностями.

Также микросателлит можно классифицировать на основа-

нии сочетания различных микросателлитных кластеров:

1) сложные микросателлиты — микросателлиты, у которых кластер состоит из нескольких смежных совершенных микросателлитных участков;

2) простые микросателлиты — микросателлиты, у которых кластер состоит

из одного совершенного микросател-

литного участка.

Хотя обычно микросателлиты наделяются эволюционно нейтральной ролью в молекуле ДНК, всё же функциональное значение их было подтверждено некоторыми опытами с различными биологическими явлениями, показанными на рисунке 1.

Рис. 1. Функции и значение микросателлитных последовательностей

ДНК

Многие аспекты распределения микросателлитов указывают на их возможную роль в таксономически специфичной организации структуры хроматина. Например, опыты по гибридизации

g 23 G

À.À. Â

ЕРГУН

, À.Å. Ã

ИРНЫК

, Ô.À. Î

СИПОВ

, À.Â. Î

МЕЛЬЧЕНКО

микросателлитных участков показали замечательное сходство в структурной организации этих участков у пшеницы и у ржи, что дало основание полагать о возможности специальной роли микросателлитных участков в организации структуры хроматина даже на уровне древних с эволюционной точки зрения компонентов генома семейства Triticeae. Было выявлено сходство в структуре хроматина локуса GWM601, обнаруженном в

коротком плече хромосомы 4А дикой пшеницы и в аналогичном локусе культурного сорта пшеницы «Китайская весна» (Triticum acstivum). Как предполагается, это сходство определяется наличием в данном локусе микросателлита (СТ)

. Считается, что

наличие коротких повторов, микросателлитов с размером кластера не более восьми нуклеотидов может иметь значение не только для стабилизации структуры хроматина, но и способно определять структуру хроматина кодирующих участков в более долгом эволюционном аспекте.

Во многих исследованиях было показано, что микросател-

литные последовательности способны к образованию

всевозможных спирализованных структур ДНК, как простых, так и сложных. Например, установлено, что микросателлитный повтор (CCG) плеты (GAA)

участвует в формировании шпильки ДНК, а три-

и (TTG)n способны образовывать петли ДНК, что

может иметь большое значение для регуляции экспрессии ге-

[

Fabregat et al., 2001]. Кроме того, было показано, что мик-

нов росателлитный повтор (AATGG)

, обнаруженный в центромер-

ных участках человеческих хромосом, принимает участие в скру-

[

чивании молекулы ДНК с образованием шпильки

]

. Аналогично этому многие короткие триплетные повто-

1999

Catasti et al.,

ры, как показывают современные исследования, принимают активное участие в формировании вторичной структуры ДНК.

В 1996 году были обнаружены длинные микросателлитные

повторы (CAG)

и (CTG)n, которые инициировали образование

вторичной структуры молекулы ДНК при ренатурации молекул, которой предшествовала денатурация. Как считают многие учёные, изучение структуры микросателлитов может способствовать открытию механизмов раскручивания молекулы ДНК, происходящих в течение транскрипции, и помочь изучению уникальных белковых последовательностей [Catasti et al., 1999].

g 24 G

ЛОНАЛЬНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И МЕХАНИЗМЫ ЕГО ФОРМИРОВАНИЯ У ЯЩЕРИЦ РОДА

Darevskia

У многих видов живых организмов наличие двухнуклеотидных микросателлитов в некодирующих участках генома является достаточно частым событием, что может указывать на возможные функции этих участков по сверхспирализации ДНК и образованию других высокоупорядоченных структур ДНК. При этом величина микросателлитного кластера является определяющим параметром, детерминирующим баланс между возможностью для последовательности ДНК эффективно

[

фективно реплицироваться

Catasti et al., 1999].

экспрессироваться и эф-

Предполагается, что многочисленные типы микросателлитных повторов выступают в качестве участков ДНК, останавливающих рекомбинацию. В подтверждение этому мнению можно привести различные опытные данные, полученные при исследовании рекомбинации в клетках млекопитающих и вирусов че-

[

ловека

Aharoni et al., 1993], дрожжей и бактерий. Подобное действие, особенно характерное для двухнуклеотидных микросателлитных повторов, объясняется высокой степенью их сродства к ферментам, тормозящим рекомбинацию [Biet et al., 1999]. Некоторые микросателлитные повторы могут влиять на рекомбинационные процессы посредством действия на саму структуру организации молекулы ДНК. Это было показано на таких микросателлитных последовательностях, как (GT)

, (GC)n, а для микросателлита (AT)n была показана воз-

(GA)

, (CA)n, (СT)n,

можность влияния на рекомбинационные процессы вплоть до Z-конформационной молекулы ДНК и даже на альтернативные

вторичные структуры ДНК [Biet et al., 1999]. Влияние на рекомбинационные процессы зависит от числа нуклеотидов в кластере. Например, проведённые исследования in vitro на GT и GC-микросателлитах показали, что частота рекомбинационных процессов для (GT) и 30% с увеличением «n» от 7, 16 и 37, соответственно

]

al., 2000

. Однако, в 2000 году Маевски и Отт, анализируя рас-

последовательностей падает от 100% до 80%

[Gendrel

пределение различных микросателлитных последовательностей и, соотнеся его с рекомбинационными событиями в 22 хромосоме человека, показали, что подобная зависимость характерна только для (GT) показали, что в локусе ARG4, содержащем (GT)

повторов. Исследования на дрожжевых клетках

микросателли-

ты, произошло наоборот увеличение частоты генной конверсии,

g 25 G

À.À. Â

ЕРГУН

, À.Å. Ã

ИРНЫК

, Ô.À. Î

СИПОВ

, À.Â. Î

МЕЛЬЧЕНКО

и что высокоповторяющиеся последовательности стимулируют образование множественных перекрёстов и совсем не способствуют одиночным перекрёстам

[Gendrel

et al., 2000]. У исследо-

вателей также есть данные, что для рекомбинации имеет значение не только число повторяющихся нуклеотидов в кластере, но и тип микросателитных повторов.

Участие микросателлитных последовательностей в регуляции клеточного цикла подтверждается исследованиями человеческого гена СНК1, где были обнаружены микросателлитные кластеры, нестабильность которых возможно запускает перерождение нормальной

клетки в раковую [Bertoni

et al., 1999]. Некоторые гены, контролирующие клеточный цикл, такие как hMSH3, hMSH6, BAX, IGFIIR, TGFbetaIIR, E2F4 и BRCA2, не-

сущие в себе короткие повторяющиеся последовательности, как предполагается, принимают важную роль в контроле роста клеток, а содержащиеся в них микросателлитные последовательности, вероятно, посредством делеций и инсерций внутри себя меняют активность генов, причём в раковых клетках нестабильность микросателлитных участков зу в нескольких из указанных генах

способствовала мутациям сра-

[

Johannsdottir et al., 2000].

Кроме того, существуют доказательства, указывающие на взаимосвязь клеточного цикла и системы репарации молекулы ДНК, заключающиеся в том, что система репарации начинает работать при экспансии (TG)

[

ный участок ДНК

Hawn et al., 1995].

повторов, повреждающих определён-

Существует много свидетельств, показывающих, что микросателлитные последовательности, локализованные в промоторных участках, могут участвовать в процессах генной активности. Так (TG)

-микросателлит, найденный в промоторном уча-

стке гена белка теплового шока hsp26 у таких организмов, как

[

Drosophila, Aspergillus и Phytophtora

Chen et al., 1997], по мне-

нию ученых, может принимать участие в некоторых элементах транскрипции данного гена. Более того, существуют доказательства, показывающие, что число нуклеотидов в кластере является ключевым фактором, определяющим не только, какой ген будет экспрессироваться, но и уровень экспрессии гена. Некоторые гены экспрессируются только лишь при строго определён-

размере кластера. Например, промотор lacZ оперона E. coli

ном

g 26 G

ЛОНАЛЬНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И МЕХАНИЗМЫ ЕГО ФОРМИРОВАНИЯ У ЯЩЕРИЦ РОДА

Darevskia

начинает работать только при наличии (GAA)n-микросателлита с «n» = 14–16, но ген не экспрессируется при «n» = 5–11.

Другие эксперименты, проведённые на (TG)

-микросателли-

тах, показали, что наличие этого типа микросателлитов в энхансерных участках некоторых вирусных генов при размере (TG)

последовательности в 30–40 п.н. способствует максимальной работе энхансеров, увеличение (TG)

[

уменьшает их активность

Hamada et al., 1984]. Кроме того, в

ловеческом геноме были найдены подобные (TG)

-кластеров до 40–130 п.н.

че-

-микроса

теллитные кластеры размером от 20 до 60 п. н., что возможно обеспечивает максимальный уровень энхансерной активности

[Hamada et al., 1984].

Некоторые микросателлитные повторы могут являться теми участками ДНК, которые отвечают за присоединение к молекуле ДНК различных регуляторных белков. Например, подобные

poly(GA) и poly(GТ) участки были обнаружены в ДНК человечес-

[

ких фибробластов или микросателлитные кластеры сложного состава (GТ)

Aharoni et al., 1993]. (GТ)n-микросателлиты

(GA)m,

обнаруженные в интронах иммунологических генов, как пред-

[

полагается, имеют высокое сродство к гистоновым белкам

]

plen et al., 1993

Ep-

Микросателлитные последовательности могут определять и трансляционные процессы. Например, сокращение числа нуклеотидов в (CA) лению

трансляционных процессов в мРНК бактерии

микросателлитном кластере способствует уси-

E. coli

Помимо этого, (CUG)n-микросателлит, располагающийся на 5′ конце мРНК, по современным данным, способен оказывать влия-

[

ние на процессы трансляции ность этому есть данные, указывающие, что (АGG)

Li et al., 2002]. В противополож-

-микроса-

теллит обладает сильным ингибиторным эффектом на трансля-

[

цию мРНК E. coli

Ivanov et al., 1992].

6.2.2. МОДЕЛИ МИКРОСАТЕЛЛИТНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ

В ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ГЕНОМАХ И ПОПУЛЯЦИЯХ

Основные механизмы, приводящие к возникновению и способствующие развитию микросателлитов — это неравный кроссинговер, проскальзывание вилок репликации и ошибки при

g 27 G

À.À. Â

ЕРГУН

, À.Å. Ã

ИРНЫК

, Ô.À. Î

СИПОВ

, À.Â. Î

МЕЛЬЧЕНКО

репарации ДНК (рис. 2). В основе последних двух механизмов лежит способность некоторых последовательностей (CGG, CTG,

CAG и др.) образовывать конформационные структуры ДНК [Wells et al., 1996] — шпильки на одной из цепей, структуры «проскальзывания» на двунитевой ДНК (вызывают задержки продвижения ДНК полимеразы) и так называемые тироиды (особые двунитевые структуры ДНК с 81 п.н. на виток — это около 27 триплетов

— характерные для CCG и CTG повторов).

1. Неравный кроссинговер приводит к увеличению числа по-

второв в одном аллеле и уменьшению — в другом. В связи с этим частота мутаций может расти с увеличением различий по длине между аллелями одного локуса [Goldstein et al., 1997].

Рис. 2. Неравный кроссиновер

2. Проскальзывание вилок репликации. Изучение проскальзывания вилок репликации как механизма нестабильности микросателлитов проводили для (CTG)

повторов у E.coli. Было по-

казано, что в зависимости от ориентации повтора относительно начальной точки (начала) репликации происходит либо уменьшение (рис. 3), либо увеличение размеров микросателлита (рис. 4). Также было выявлено, что нарушение процесса репликации происходит на «отстающей» цепи. Если CTG тринуклеотид расположен на ДНК-матрице для синтеза «дочерней» цепи,

то на ней могут возникать шпильки за счет образования антипараллельных дуплексов между Т-остатками. Вновь синтезированная цепь ДНК будет содержать меньшее число повторов, чем в исходной цепи [Wells et al., 1996].

g 28 G

Рис.3. Проскальзывание вилки репликации при уменьшении числа повторов

ЛОНАЛЬНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И МЕХАНИЗМЫ ЕГО ФОРМИРОВАНИЯ У ЯЩЕРИЦ РОДА

Darevskia

Рис. 4. Проскальзывание вилки репликации при увеличении числа повторов

Если же CTG олигомеры находятся в растущей цепи, то эти повторы могут образовывать шпильки, что приводит к увеличению числа (экспансии) повторов в новой цепи.

Образование шпилек на растущей цепи может быть вызвано «прыжками» ДНК-полимеразы в области 5’ концов фрагментов Оказаки, и, следовательно, приводить к увеличению размера «дочерней» цепи

ДНК.

3. Увеличение числа повторов при репарации. Повреждения

ДНК, вызывающие одно- и двунитевые разрывы, приводят к появлению свободных однонитевых участков ДНК. Эти последовательности могут образовывать шпильки, и последующая

репликация, восстанавливающая поврежденную ДНК, приводит к увеличению числа повторяющихся звеньев в микросателлите (рис. 5).

Рис. 5. Увеличение числа повторов при репарации

Факторы, влияющие на нестабильность микросателлитов:

Последовательность олигонуклеотида, образующего

звено микросателлита [Goldstein et al., 1997].

Длина микросателлита — чем длиннее микросател-

лит, тем более он нестабилен. Например, плазмида pUC19, содержащая более 160 повторов CGC три-

плета, характеризовалась повышенной нестабильностью этих микросателлитных кластеров [Wells

et al., 1997].

Различные нарушения, приводящие к дестабилиза-

ции микросателлита.

g 29 G

À.À. Â

ЕРГУН

, À.Å. Ã

ИРНЫК

, Ô.À. Î

СИПОВ

, À.Â. Î

МЕЛЬЧЕНКО

Ориентация звеньев микросателлита относительно

точки начала репликации [Wells et al., 1997].



Частота исправлений таких нарушений, как образование неспаренных оснований в ДНК-матрице или в тущей цепи ДНК, при репарации (mismatch repair).

рас-

Например, изучение линий дрожжей, мутантных по генам, контролирующим систему репарации неспаренных оснований, выявило увеличение нестабильности участков ДНК, состоящих из повторяющейся GT

по-

следовательности [Strand et al., 1993; Vilkki et al., 2001].

Использование микросателлитов в популяционно-генетических исследованиях зависит от их информативности — для многих локусов, содержащих такие последовательности, характерен высокий уровень аллельных вариаций, однако, из-за большого числа копий повторяющегося звена, не удается получить удовлетворительные картины блот-гибридизации с набором характерных дискретных рестриктных фрагментов. Например, для совершенных повторов

типа (dC – dA)n  (dG – dT)n наибольшая информативность была обнаружена для n = 11 – 17 [Weber et al., 1993]. Объяснение закономерностей мутационных изменений в микросателлитах и их значение для популяционно-генетичес-

исследований получило отражение в «одноступенчатой»

ких

«двухступенчатой» мутационных моделях.

Согласно «одноступенчатой мутационной модели» размер новых аллелей (число повторяющихся единиц — i) микросателлита увеличивается или уменьшается на одно звено; все аллели случайно распределены в популяции и имеют одинаковое селективное значение. Вероятность изменения числа повторяющихся единиц (i) составляет u/2 на поколение; число аллелей микросателлита растет согласно функции 4Nu,

т. е. зависит от раз-

мера исходного аллеля [Valdes et al., 1993].

Изменения в микросателлитах в соответствии с «двухступенчатой мутационной моделью» представляют собой совокупность одноступенчатых, т. е. изменение числа повторов на единицу или очень небольшое число звеньев, и скачкообразных (быстрое большое увеличение повторяющихся единиц) изменений. За основу было положено, что каждый локус нейтрален

и изменение

численности популяции происходит случайно [Di Rienzo et al.,

1994].

g 30 G

<<< < Предыдущая 1 23 / 103 4 5 6 7 8 9 10 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]