Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Радиационная биофизика. Лабораторный практикум
.pdf
Исследование комбинированного действия ионизирующего излучения и температуры на микроорганизмы
и молекулы, являются первым этапом развития лучевого поражения. Ионизированные и возбужденные атомы и молекулы
в течение 10–6 с взаимодействуют как между собой, так и с различными молекулярными системами, давая начало химически
активным центрам (свободные радикалы, ионы, ионные радикалы и др.). В этот же период возможно образование разрывов
связей в молекулах как за счет непосредственного взаимодействия с ионизирующим агентом, так и за счет внутри- и межмолекулярной передачи энергии возбуждения.
В дальнейшем имеют место реакции химически активных веществ с различными биологическими структурами, при которых
отмечается как деструкция, так и образование новых, несвойственных для облучаемого организма соединений.
Первичным актом этого действия является возбуждение
и ионизация молекул, в результате чего возникают свободные
радикалы (прямое действие излучения) или начинается химическое превращение (радиолиз) воды, продукты которого (радикал ОН, перекись водорода — H2O2) вступают в химическую
реакцию с молекулами биологической системы.
Первичные процессы ионизации не вызывают больших нарушений в живых тканях. Повреждающее действие излучения
связано с вторичными реакциями, при которых происходит
разрыв связей внутри сложных органических молекул, например, SH-групп в белках, хромофорных групп азотистых оснований в ДНК, ненасыщенных связей в липидах.
Влияние ионизирующего излучения на клетки обусловлено взаимодействием свободных радикалов с молекулами белков, нуклеиновых кислот и липидов, когда вследствие всех этих процессов
образуются органические перекиси и возникают быстропроходящие реакции окисления. В результате перекисного окисления накапливается множество измененных молекул, из-за чего начальный радиационный эффект многократно усиливается. Все это
отражается, прежде всего, на структуре биологических мембран:
меняются их сорбционные свойства и повышается проницаемость.
61
Лабораторная работа № 6
Высвобождающиеся гидролитические ферменты могут путем простой диффузии достичь любой органеллы клетки, в которую они легко проникают благодаря повышению проницаемости мембран. Под действием этих ферментов происходит
дальнейший распад макромолекулярных компонентов клетки, в том числе нуклеиновых кислот, белков. Разобщение окислительного фосфорилирования в результате выхода ряда ферментов из митохондрий, в свою очередь, приводит к угнетению
синтеза АТФ, а отсюда — и к нарушению биосинтеза белков.
Происходит инактивация ферментов, разрушение мембранных
структур, ядерного аппарата.
Таким образом, в основе радиационного поражения клетки
лежит нарушение ультраструктур клеточных органелл и связанные с этим изменения обмена веществ.
ИИ действует на клетки тем сильнее, чем они моложе и менее дифференцированы.
Повреждающее действие ИИ на клетки при достаточно высоких дозах завершается гибелью. Гибель клетки в основном
является результатом подавления митотической активности
и необратимого нарушения хромосомного аппарата клетки,
но возможна и интерфазная гибель (вне периода митоза) из-за
нарушения метаболизма клетки и интоксикации упомянутыми выше радиотоксинами.
Радиоустойчивость различных организмов колеблется в широких пределах, причем микроорганизмы значительно радиоустойчивее высших организмов (в сотни и тысячи раз). Наиболее устойчивы к действию ИИ споры бактерий, затем грибы
и дрожжи и далее бактерии.
Последующие этапы развития лучевого поражения проявляются в нарушении обмена веществ в биологических системах
с изменением соответствующих функций. У высших организмов это протекает на фоне нейрогуморальной реакции на развитие нарушения.
62
Исследование комбинированного действия ионизирующего излучения и температуры на микроорганизмы
Биологические эффекты малых доз облучения
Оценивая биологическое последствие облучения организмов, удобно делить их на летальные (возникающие в результате
действия излучений в больших дозах), сублетальные (нелетальные), инициируемые воздействие ИИ в малых и средних дозах.
Биологический ответ на облучение в нелетальных дозах имеет немонотонный характер (рис. 6.1).
I
III
норма
ЕРФ
II
(стимуляция) ОТВЕТ (повреждения)
Рис. 6.1. Биологические эффекты облучения организмов
в сублетальных дозах:
I — эффекты облучения в «сверхмалых» дозах; II — эффекты облучения в малых
дозах; III — развитие структурно-функциональных повреждений при облуче-
нии в «средних сублетальных» дозах
Дозы
облучения
Численные физические величины диапазона малых доз для
разных организмов сильно различаются.
Естественный радиационный фон — «ультрамалые дозы»
природного радиационного фона (~1 мЗв/год) — представляет собой низший уровень наносимого ионизирующими излучениями организму вреда без дополнительного облучения.
63
Лабораторная работа № 6
Существует ряд экспериментов, в которых описано замедление скорости деления клеток микроорганизмов при снижении внешнего ЕРФ. Такие исследования подтвердили выводы
о положительной роли ЕРФ в жизнедеятельности организмов.
Эффект «гиперрадиочувствительности» представляет собой
всплеск повреждений при воздействии «сверхмалыми» дозами
(от ЕРФ до ~ 5–20 сГр). Происходит нарушение окислительно-восстановительного гомеостаза, аберрации хромосом, выход клеток с микроядрами и другие показатели. Данный эффект
продемонстрирован во многих опытах. Показано, что в основе его лежат нарушения конкурентных отношений между прои антиоксидантами в окислительно-восстановительном гомеостазе. Эти изменения наблюдаются как при кратковременном,
так и пролонгированном облучении в сверхмалых дозах.
Радиационный гормезис — это неспецифический эффект
воздействия на живые организмы в малых дозах, вызывающих
изменения, диаметрально противоположные повреждающим
эффектам при воздействии в больших дозах. Оказывает стимулирующее действие на рост, развитие и жизнедеятельность
клеток.
В области «средних сублетальных» доз начинается участок
с прямой зависимостью ответа (размера повреждения) от величины дозы облучения.
Механизм клеточного восстановления от радиационных
повреждений
В клетках функционирует сложнейший комплекс ферментных систем, поддерживающих структурную целостность генома. К одной из них относят разнообразные ферменты репарации
ДНК, распознающие дефекты ее структуры, «ремонтирующие»
ее при лучевых повреждениях путем специфического устранения
различных повреждений и восстановления структуры и функции
ДНК, а вместе с тем и нормального клеточного деления.
64
Исследование комбинированного действия ионизирующего излучения и температуры на микроорганизмы
Влияние температуры на жизнедеятельность микроорганизмов
Температура среды — один из основных факторов, определяющих возможность и интенсивность развития микроорганизмов. Каждая группа микроорганизмов может развиваться лишь в определенных пределах температуры: для одних эти
пределы узкие, для других — относительно широкие и исчисляются десятками градусов.
Влияние высоких температур
Превышение температуры среды над оптимальной сказывается на микроорганизмах более неблагоприятно, чем ее понижение. Отношение различных микроорганизмов к температурам,
превышающим максимальную для их развития, характеризует
их термоустойчивость. У разных микроорганизмов она неодинакова. Температуры, превышающие максимальную, вызывают явление «теплового шока». При непродолжительном пребывании в таком состоянии клетки могут дезактивироваться,
а при длительном — наступает их отмирание. Большинство бесспоровых бактерий отмирает в течение 15–30 мин при нагревании во влажном состоянии до + (60…70) °C, а при нагревании
до + (80…100) °C — в течение времени от нескольких секунд
до 1–2 мин. Дрожжи и мицелиальные грибы погибают также
довольно быстро при температуре + (50…60) °C.
Отмирание микроорганизмов при нагревании во влажной
среде наступает вследствие происходящих необратимых изменений в клетке. Основными из них являются денатурация
белков и нуклеиновых кислот клетки, а также инактивация
ферментов и возможное повреждение цитоплазматической
мембраны.
При воздействии на клетки «сухого жара» (без влаги) гибель
происходит в результате активных окислительных процессов
и нарушения клеточных структур. На губительном действии
65
Лабораторная работа № 6
высокой температуры основан один из важнейших и широко
применяемых в микробиологической и медицинской практике приемов — стерилизация.
Влияние низких температур
Холодоустойчивость различных микроорганизмов колеблется в широких пределах. При температуре среды ниже оптимальной снижается скорость размножения микроорганизмов и интенсивность их жизненных процессов.
Многие микроорганизмы не способны развиваться при температуре ниже нуля. Некоторые микроорганизмы временно могут выдерживать очень низкие температуры. Кишечная и брюшнотифозная палочки в течение нескольких дней не погибают
даже при температурах — (172 …190) °C. Споры бактерий сохраняют способность к прорастанию даже после 10-часового пребывания при –252 °C (температура жидкого водорода).
Некоторые мицелиальные грибы и дрожжи сохраняют жизнеспособность после воздействия температуры –190 °C (температура жидкого воздуха) в течение нескольких дней, а споры мицелиальных грибов — в течение нескольких месяцев.
Причинами смерти микроорганизмов при действии низких температур являются: нарушение обмена веществ; увеличение осмотического давления среды вследствие вымораживания воды; в клетках могут образоваться кристаллики льда,
разрушающие клеточную стенку.
При температурах ниже минимальной микроорганизмы
не размножаются, их активная жизнедеятельность приостанавливается, многие из них неопределенно долгое время остаются
жизнеспособными, переходя в анабиотическое состояние. При
повышении температуры они вновь возвращаются к активной
жизни. Однако некоторые микроорганизмы в таких условиях
скоро погибают. Отмирание происходит значительно медленнее, чем под действием высоких температур.
66
Исследование комбинированного действия ионизирующего излучения и температуры на микроорганизмы
Комбинированное действие ионизирующего излучения
и температуры
Влияние ионизирующего излучения и высоких температур
Комбинированное действие повышенной температуры и ионизирующей радиации нашло широкое применение в онкологии, поскольку гипертермия является сильным модификатором радиочувствительности клеток. Гипертермия позволяет
при меньших дозах ионизирующей радиации добиться некроза
опухоли, при этом часто наблюдается явление синергизма. В лечебных целях гипертермию создают местно, в районе опухоли.
Закономерности комбинированного действия ионизирующего излучения и гипертермии достаточно широко изучены
для микроорганизмов.
Были проведены экспериментальные исследования восстановления дрожжевых клеток после последовательного и одновременного терморадиационного воздействия.
Результаты экспериментальных исследований показывают,
что при последовательном действии гипертермии с ИИ с увеличением продолжительности действия гипертермии эффективность комбинированного воздействия прогрессивно возрастала. При этом как объем, так и скорость восстановления
уменьшались с увеличением тепловой нагрузки. Эти данные
подтверждают наиболее распространенную точку зрения об участии процессов восстановления в механизме синергического
взаимодействия.
Повышение доли невосстанавливающихся дрожжевых клеток с увеличением температуры, при которой происходило облучение ионизирующим излучением, сопровождалось увеличением доли клеток, погибающих без деления и не способных
к восстановлению.
При фиксированной мощности дозы ионизирующего излучения синергическое усиление радиационного эффекта ги-
67
Лабораторная работа № 6
пертермией происходит лишь в определенном температурном
диапазоне. При температурах, выходящих за пределы этого
диапазона, взаимодействие агентов характеризуется аддитивностью.
Применение ионизирующего излучения и гипертермии характеризуется синергическим взаимодействием при определенном соотношении повреждений, индуцируемых обоими
агентами. Максимальный синергизм проявляется при одновременном применении агентов. Увеличение интервала времени
между облучением и гипертермическим воздействием приводит к уменьшению синергического эффекта.
Влияние ионизирующего излучения и низких температур
В экспериментах по исследованию влияния совместного действия ионизирующего излучения и низких температур
было замечено, что чувствительность к облучению клеток, замороженных при –10 °C, была снижена наполовину. Вместе
с тем клетки, замороженные до –10 °C и затем согретые, обладали обычной чувствительностью к облучению при 0 °C. Следовательно, процесс замораживания до –10 °C и оттаивания
не вносил изменений в их структуры. Чувствительность к облучению снижалась еще на 25 % при понижении температуры
от –10 до –30 °C. Однако в интервале от –30 до –72 °C наблюдалось поразительное повышение чувствительности к облучению. При этом во всех опытах была принята поправка на число клеток, погибших во время замораживания и оттаивания.
Повышенную устойчивость замороженных клеток к ионизирующему излучению объясняли тем, что токсические продукты
облучения в известной степени теряют способность диффундировать в цитоплазму и инактивировать наиболее чувствительные или жизненно важные компоненты клеток. Можно было бы
предположить, что по мере уменьшения температуры снижается и скорость диффузии, а одновременно с этим ослабевает
68
Исследование комбинированного действия ионизирующего излучения и температуры на микроорганизмы
и губительное действие ионизирующего излучения. Результаты, полученные в экспериментах, не подтвердили этого предположения, в связи с чем возникла необходимость исследовать
влияние замораживания на дрожжевые клетки при разных скоростях охлаждения и различных конечных температурах.
Микроскопические исследования по охлаждению с различной скоростью взвеси дрожжей и наблюдение процесса образования льда объясняют разную чувствительность дрожжевых
клеток к излучению. При быстром замораживании при температуре от –2 до –10 °C происходила внеклеточная кристаллизация льда и клетки постепенно сжимались. При быстром замораживании при –78 и –190 °C кристаллы льда появлялись
и внутри клеток. Разной локализацией кристаллов льда можно
объяснить неодинаковую чувствительность дрожжевых клеток,
охлажденных до различных температур, к рентгеновским лучам.
При действии ИИ в замороженных клетках возникают свободные радикалы в равных количествах на каждую единицу
объема воды, независимо от того, находится ли она в жидком
состоянии или в замерзшем, внутри или вне клетки. Если эти
свободные радикалы и их продукты образовались во льду, они,
вероятно, будут фиксироваться в месте своего возникновения
и смогут лишь постепенно, очень медленно диффундировать оттуда. При вымерзании большого объема воды вне клеток фиксированные во внеклеточных пространствах свободные радикалы,
высвобождаясь при оттаивании, будут растворяться во внешней среде и не смогут причинить вреда уязвимым и жизненно
важным частям клеток. Предполагается, что уменьшение чувствительности дрожжевых клеток к облучению при температурах от 0 до –30 °C обусловлено тем, что по мере понижения температуры увеличивается объем воды, вымерзающей вне клеток.
В то же время при быстром охлаждении до температур ниже
–30 °C какая-то часть воды в цитоплазме вымерзает внутри самих клеток. Объем внутриклеточного льда зависит от температуры замораживания. При температуре –72 °C вся клеточная
69
Лабораторная работа № 6
вода может быть заморожена in situ. Во время облучения свободные радикалы фиксируются внутри клеток и после оттаивания могут нанести повреждение жизненно важным и уязвимым
частям клеток. Этим, по-видимому, можно объяснить тот факт,
почему дрожжевые клетки, быстро охлажденные до –72 °C и облученные при этой температуре, были так же чувствительны
к рентгеновским лучам, как и клетки, облученные в жидкой
фазе или при температуре, близкой к 0 °C.
Оборудование и материалы
1. Микроскоп МБИ-15.
2. Счетная камера Горяева.
3. Краситель метиленовый синий.
Пункты 1–3 подробнее описаны в лабораторной работе № 1.
4. В экспериментах по изучению влияния гипертермии на микроорганизмы для нагрева суспензии использовать электрический сушильный шкаф, позволяющий проводить нагрев до 100 °C.
5. Для контроля температуры использовать термометр
технический ТТЖ-М, позволяющий проводить измерения
от 0 до 100 °C.
Объекты исследования
В экспериментах будут использованы дрожжи вида Saccharomyces cerevisiae штамма JAY291. Оптимальный диапазон температур
для размножения данного штамма дрожжей составляет 20–25 °C.
Подробнее о дрожжах описано в лабораторной работе № 1.
Порядок выполнения работы
1. Исследование влияния высоких и низких температур
Приготовьте суспензию дрожжей (минимум за 5 часов
до проведения лабораторной работы, чтобы дрожжи находились в стационарной фазе роста).
70
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]