Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Основы микробиологии. Учебное пособие
.pdf
41
продуктов, их культуральными свойствами, с представителями
отдельных классов. Освоить технику микроскопического
исследования грибов и дрожжей в препаратах «раздавленная капля» и
технику микроскопирования живых неокрашенных объектов.
Материалы, реактивы, оборудование: микроскоп;
препаровальные иглы и бактериологические петли; предметные и
покровные стекла; пипетка; фильтровальная бумага; спиртовка; лоток
с рельсами для предметных стекол; иммерсионное масло; культуры
грибов родов Mucor, Penicillium, Aspergillus, Alternaria; чистая
культура дрожжей Saccharomyces cerevisiae; пекарские и винные
дрожжи; 96%-ный этиловый спирт; дистил. вода; 0,5%-ный спиртовой
раствор краски судан 111; раствор Люголя.
Опыт № 1. Исследование грибов
Приготовление препаратов методом «раздавленная капля»:
1. На предметное стекло трубочкой или пипеткой наносят
большую каплю воды или этилового спирта.
2. Зажигают спиртовку, прокаливают препаровальную иглу над
пламенем горелки и отбирают небольшое количество мицелия из
пробирки или чашки Петри, соблюдая правила асептики.
3. Мицелий аккуратно помещают в каплю, нанесенную на
предметное стекло и с помощью двух игл расправляют его в воде.
4. Препарат накрывают покровным стеклом и слегка
придавливают. Излишки воды удаляют с помощью фильтровальной
бумаги. При недостатке жидкости ее добавляют, подпуская пипеткой
под покровное стекло.
5. Микроскопируют препарат «раздавленная капля» сначала с
объективом 8x, а затем 40 в затемненном поле зрения (конденсор
опущен, шторка ирис-диафрагмы прикрыта).
При отборе и микроскопии препаратов грибов учитывают
следующие рекомендации:
а) гриб рода Mucor. Отбирают черновато-серый пушистый
воздушный мицелий. При микроскопии обращают внимание на гифы
с заполненными спорами спорангиями и колонки, которые
образуются при освобождении спорангия;
б) гриб рода Penicillium. При отборе стараются взять молодой
мицелий (на границе окрашенного и белого мицелия), углубляясь
иглой в среду. Обращают внимание на септированные гифы с
кисточками;
41
42
в) гриб рода Aspergillus. Отбирают немного пушистого мицелия с
окрашенными конидиями, слегка углубляясь иглой в питательную
среду. Обращают внимание на несептированные конидиеносцы;
г) гриб рода Alternaria. Берут грибницу в черных участках,
углубляясь в нее иглами. Обращают внимание на септированный
мицелий, слабо развитые конидиеносцы и крупные конидии,
имеющие вид округлых или заостренных многоклеточных
образований, напоминающих «гранаты-лимонки».
Опыт № 2. Исследование дрожжей
Для лабораторных занятий могут быть использованы пекарские
дрожжи. Небольшой кусочек дрожжевой массы за несколько часов до
занятий помещают в теплую подсахаренную воду и ставят в теплое
место. Образуется беловатая мутная жидкость. Каплю этой жидкости
наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом, сверху наносят каплю кедрового масла и просматривают препарат с иммерсионной системой. Клетки хорошо видны и при меньших увеличениях.
В пекарских дрожжах обычно присутствуют две расы: одна
представлена округло-эллипсовидными клетками, быстро разъединяющимися при почковании; другая – удлиненно-цилиндрическими,
образующими при почковании ветвистые кустики (псевдомицелий).
На многих клетках видны почки. В мелкозернистом содержимом живых дрожжей хорошо заметны крупные прозрачные вакуоли, занимающие иногда центральное положение. Цитоплазма обнаруживается
при микроскопировании как более темная зернистая масса, капли жира – светлые, блестящие (сильно преломляют свет), гликоген – в виде
плотных зерен.
Для установления химической природы внутриклеточных включений применяют микрохимические реакции.
Для выявления гликогена к капле дрожжей (хлебных или винных) перед тем как их накрыть покрывным стеклом, добавляют каплю
Люголя: гликоген окрашивается в красно-бурый цвет. Если гликогена
в клетках нет или мало – дрожжи незрелые или старые.
При добавлении к капле дрожжей (круглых) капли 0,5%-ного
спиртового раствора краски судан 111 можно обнаружить жир (окрасится в красно-желтый цвет).
42
43
Оформление и анализ результатов исследований
1. Кратко законспектировать теоретический материал.
2. Промикроскопировать грибы, дрожжи – хлебные, винные,
кефирные (с объективом 40х при слабо освещенном поле зрения).
3. Рассмотреть и зарисовать микроскопические картины
исследованных культур грибов и дрожжей с учетом морфологических
особенностей каждого микроорганизма. Под каждым рисунком
подписать латинское название и увеличение препарата.
4. Измерить клетки хлебных дрожжей, выбрав непочкующиеся
клетки.
5. Убедиться в отсутствии подвижности дрожжей (приняв во
внимание возможное перемещение клеток с потоком жидкости).
6. Описать культуральные свойства изучаемых грибов.
После ознакомления с данной темой студенты могут определять
форму и виды грибов и дрожжей, встречающихся при производстве
пищевых продуктов, их культуральные свойства и морфологические
особенности, освоят технику микроскопического исследования
грибов и дрожжей в препаратах «раздавленная капля» и технику
микроскопирования живых неокрашенных объектов, необходимые
для исследования продуктов питания и других объектов.
Контрольные вопросы
1. Как делят грибы в зависимости от строения мицелия?
2. Какие классы грибов являются высшими грибами?
3. Назовите способ размножения микроскопических грибов.
4. Как готовят препараты микроскопических грибов и дрожжей?
5. Охарактеризуйте морфологические и культуральные свойства микро-
скопических грибов.
6. Какие грибы используют в промышленности для получения орга-
нических кислот, ферментов, антибиотиков и других ценных продуктов?
7. Опишите грибы рода Penicillium.
8. Охарактеризуйте морфологические свойства дрожжей.
9. Что такое культурные дрожжи? В каких отраслях пищевой промышлен-
ности они используются?
10. Обладают ли дрожжи подвижностью?
11. Как производить измерение дрожжей?
12. Как обнаружить в клетках дрожжей гликоген и жир?
[1, с. 36–67; 4; 5; 10, с. 10–20; 12, с. 10–20; 13, с. 23–42]
43
44
ТЕМА 4. АНАЭРОБНОЕ РАЗЛОЖЕНИЕ (БРОЖЕНИЕ)
Брожение − это анаэробный (происходящий без участия кисло-
рода) метаболический распад молекул питательных веществ, например глюкозы. По выражению Луи Пастера, «брожение − это жизнь
без кислорода». Большинство типов брожения осуществляют микроорганизмы − облигатные или факультативные анаэробы.
Термин «брожение» также используется в более широком смысле
для обозначения бурного роста микроорганизмов в соответствующей
среде. При использовании в этом смысле не делается различия между
аэробным и анаэробным метаболизмом.
Брожение часто используется для приготовления или сохранения
пищи. Говоря о брожении, обычно имеют в виду брожение сахара (превращение его в спирт) с использованием дрожжей, но,
к примеру, при производстве йогурта используются другие виды
брожения.
Использование брожения человеком обычно предполагает применение определенных видов и штаммов микроорганизмов. Вина
иногда улучшают с использованием процесса взаимного брожения.
Молочнокислые бактерии подразделяют на 2 группы – гомофер-
ментативные и гетероферментативные. Гомоферментативные
бактерии (например, Lactobacillus delbrückii) расщепляют моносахариды с образованием двух молекул молочной кислоты в соответствии
с суммарным уравнением:
C6H12O6 = 2CH3CHOH-COOH.
Гетероферментативные бактерии (например, Bacterium lactis
aerogenes) ведут сбраживание с образованием молочной кислоты, уксусной кислоты, этилового спирта и CO2, а также образуют небольшое количество ароматических веществ − диацетила, эфиров и т. д.
При молочнокислом брожении превращение углеводов, особенно
на первых этапах, близко к реакциям спиртового брожения, за исключением декарбоксилирования пировиноградной кислоты, которая восстанавливается до молочной кислоты за счёт водорода, получаемого
от НАД-Н. Гомоферментативное молочнокислое брожение используется для получения молочной кислоты, при изготовлении различных
кислых молочных продуктов, хлеба и в силосовании кормов в сельском хозяйстве. Гетероферментативное молочнокислое брожение
44
45
происходит при консервировании различных плодов и овощей путём
квашения.
Молочнокислое брожение представляет собой разложение сахара под действием молочнокислых бактерий с образованием молочной
кислоты. В общем суммарном виде его можно представить следующим уравнением:
С6Н12О6 = 2С3Н6О3 + 18 ккал.
Это брожение часто наблюдается в молоке и вызывает его скисание. Отсюда и получили свое название вид брожения, бактерии, вызывающие его, а также основной продукт брожения − кислота. Молочнокислые бактерии бывают шаровидной и палочковидной формы.
Они неподвижны, спор не образуют и являются факультативными
анаэробами.
Различные виды молочнокислых бактерий в равных условиях
продуцируют разное количество кислоты, что объясняется их неодинаковой кислотоустойчивостью. Палочковидные бактерии образуют
больше кислоты, чем шаровидные (кокки).
Молочнокислые бактерии способны сбраживать только моно- и
дисахариды и совсем не сбраживают крахмал и другие полисахариды,
так как не выделяют соответствующих ферментов. Некоторые из этих
бактерий вырабатывают антибиотические вещества, действующие
против возбудителей кишечных заболеваний.
Молочнокислые бактерии широко распространены в природе,
они постоянно встречаются в почве, на различных растениях, на плодах и овощах, в молоке и т. д.
Наибольшее значение имеют следующие молочнокислые бактерии: молочнокислый стрептококк, болгарская, ацидофильная, сырная, дельбрюковская, огуречная, капустная палочки и др.
Молочнокислый стрептококк − соединенные попарно или в короткие цепочки шаровидные бактерии. Лучше всего развиваются при
температуре 30−35 °С, их температурный минимум около 10 °С. При
брожении накапливают до 1 % кислоты. Широко применяются для
приготовления молочнокислых продуктов (простокваши, кефира,
сметаны, творога и др.).
Болгарская палочка нередко образует длинные цепочки, выделена из болгарской простокваши. Представляет собой неподвижную, бесспоровую палочку. Наилучшая для ее развития температура 40−45 °С, температурный минимум 20 °С. В молоке образует до
3,5%-ной молочной кислоты.
45
46
Ацидофильная палочка получена из выделений кишечника грудного ребенка. Имеет температурный оптимум около 40 °С, минимальная температура развития 20 °С. В молоке накапливает до
2,2%-ной молочной кислоты. Применяется для приготовления молочнокислых продуктов − ацидофилина и ацидофильного молока.
Сырная палочка имеет температурный оптимум около 40 °С, используется в сыроделии.
Дельбрюковская палочка представляет собой одиночные или собранные в короткие цепочки клетки, не образующие спор. Температурный оптимум 45 °С. Образует в среде до 2,5%-ной кислоты. Применяется для промышленного получения молочной кислоты, а также
в производстве хлебных заквасок.
Огуречная и капустная палочки развиваются при квашении овощей. Молочнокислое брожение имеет важное промышленное значение. Оно применяется в производстве молочнокислых продуктов, в
хлебопечении, в процессах квашения овощей и силосования кормов,
при изготовлении кваса, в производстве молочной кислоты и т. д.
Молочнокислое брожение в хлебопечении позволяет предотвратить развитие вредных бактерий в тесте, вызывающих картофельную болезнь (тягучесть) хлеба, а также способствует улучшению вкусовых свойств хлеба.
Молочная кислота, образующаяся в результате этого брожения,
придает особый вкус квашеным овощам и препятствует развитию
гнилостных бактерий.
При маслянокислом брожении происходит процесс разложения
сахара под действием бактерий в анаэробных условиях с образованием масляной кислоты, углекислого газа и водорода. Оно протекает по
уравнению:
С6Н12О6 = С3Н7СООН + 2СО2 + 2Н2 + 20 ккал.
В качестве побочных продуктов при этом получаются этиловый и
бутиловый спирты, уксусная кислота и др. Такое брожение может
протекать в молоке и молочных продуктах, придавая им неприятные
вкус и запах, характерные для масляной кислоты. Маслянокислые
бактерии, вызывающие это брожение, представляют собой перитрихиально жгутованные подвижные, спорообразующие палочки, температурный оптимум их развития находится в пределах 30−40 °С. Они
являются строгими анаэробами и могут размножаться только при
полном отсутствии кислорода воздуха или при очень незначительном
его содержании. Споры, образуемые маслянокислыми бактериями,
46
47
весьма устойчивы к неблагоприятным воздействиям, выдерживают
кипячение в течение нескольких минут и погибают только при длительной стерилизации. Располагаются они либо в середине, либо
ближе к одному из концов клетки, придавая ей форму веретена или
теннисной ракетки.
Маслянокислые бактерии способны сбраживать как простые сахара, так и более сложные углеводы − крахмал, пектиновые вещества
и другие, а также глицерин. Эти бактерии широко распространены в
природе, находясь в почве, в иле озер, прудов и болот, в скоплениях
различных остатков и отбросов, навозе, загрязненной воде, молоке,
сыре и т. д. Вызываемое этими бактериями брожение имеет важное
значение в превращениях веществ в природе.
В народном хозяйстве маслянокислое брожение может принести
большой вред, так как маслянокислые бактерии способны вызывать
массовую гибель картофеля и овощей, прогоркание молока и вспучивание сыров, порчу консервов и т. д.
На маслянокислые бактерии подавляюще действует кислая реакция среды, поэтому там, где развиваются молочнокислые бактерии,
выделяющие молочную кислоту, жизнедеятельность маслянокислых
бактерий приостанавливается. Если же в заквашенных овощах медленно накапливается молочная кислота, то они могут быть испорчены
в результате размножения в них маслянокислых бактерий. Эти бактерии вызывают порчу пастеризованного молока, в котором исключено
молочнокислое брожение, а также сырого молока при длительном
хранении его на холоде, когда деятельность молочнокислых бактерий
ослаблена.
Развиваясь во влажной муке, маслянокислые бактерии придают
ей прогорклый вкус. Маслянокислое брожение находит практическое
применение в производстве масляной кислоты, которая широко используется в технике.
Методика выполнения лабораторной работы
Цель работы: изучить процесс брожения как результат жизнеде-
ятельности молочнокислых и маслянокислых бактерий.
Материалы, реактивы, оборудование: микроскоп; бактериологические петли и пипетки; покровные и предметные стекла; спиртовка; термостат; батистовая салфетка; набор пробирок; фильтровальная
бумага; метиленовая синь; иммерсионное масло; бензин; молоко;
кисло-молочный продукт; неочищенный картофель; мел; раствор Лю-
47
48
голя; смесь спирта и эфира (1:1); 5%-ный раствор FeCl3; этиловый
спирт; концентрированная серная кислота.
Опыт № 1. Получение микроорганизмов процесса молочнокислого брожения
Инокулятом для получения накопительных культур молочнокислых бактерий могут служить кисломолочные продукты.
В качестве питательной среды используют стерильное молоко. В
пробирку со стерильным молоком вносят 1 мл кислого молока или
другого молочнокислого продукта. Пробирку с посевом и контрольную (со стерильным молоком) ставят в термостат при 30−32 °С на 1−2
дня (при 20−25 °С на неделю). Затем отмечают по свертыванию молока характер роста микроорганизмов − образование сгустка (плотного,
рыхлого, слизистого), газообразование. Далее проводят микроскопирование препарата фиксированных клеток, приготовленного из культуральной жидкости. Отмечают морфологические особенности бактериальных клеток: форму, спорообразование, подвижность и т. д.
Учитывая особенность субстрата (молока), препарат фиксированных клеток готовят следующим образом: на обезжиренное предметное стекло из пробирки с помощью стерильной бактериологической петли наносят каплю культуральной жидкости, которую равномерно размазывают покровным стеклом. Мазок высушивают на воздухе, фиксируют (захватывают предметное стекло мазком вверх пинцетом и 3 раза проводят через пламя горелки) и одновременно обезжиривают смесью спирта и эфира (1:1) в течение 10 мин, которую
наносят непосредственно на мазок. После испарения смесь наливают
повторно. Высушенный мазок окрашивают мегиленовым синим (фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки;
наносят на стекло из пипетки раствор красителя; срок окрашивания
колеблется от 1 до 3 мин; в этот период краситель должен покрывать
весь мазок, затем его смывают легкой струей воды, при этом смывается краситель, не адсорбированный микроорганизмами; потом препарат высушивают, осторожно промокая его фильтровальной бумагой).
Опыт № 2. Получение микроорганизмов процесса маслянокислого брожения
Для получения накопительной культуры маслянокислых бактерий в большую пробирку емкостью 50 мл помещают несколько кусочков неочищенного картофеля, четверть чайной ложки мела, зали-
48
49
вают водопроводной водой (расстояние до пробки 2−3 см), закрывают
ватной пробкой и пастеризуют при 80 °С в течение 10 мин на водяной
бане, после чего помещают в термостат при 37 °С.
Через 1−2 суток в жидкости на дне пробирки при микроскопировании обнаруживается большое количество подвижных палочек. Отличительной способностью маслянокислых бактерий является их способность накапливать в клетках запасное вещество − гранулезу, а
также образовывать споры. При спорообразовании клетки утолщаются либо в середине, либо в конце клетки. После созревания спор гранулеза в клетках исчезает.
После 5−6 дней культивирования анализируют накопительную
культуру. Для приготовления микроскопического препарата культуральную жидкость с микроорганизмами берут пипеткой со дна пробирки, вблизи ломтиков картофеля.
Для обнаружения в культуральной жидкости масляной кислоты
проводят две качественные реакции.
1. В сухую чистую пробирку вносят 3−5 мл культуральной жидкости, взятой из середины пробирки с накопительной культурой. Добавляют 1−2 мл 5%-ного раствора хлорного железа. Слегка подогревают. Наблюдают появление кирпично-бурого окрашивания из-за появления маслянокислого железа.
2. В сухую чистую пробирку вносят 3−5 мл культуральной жидкости, взятой из середины пробирки с накопительной культурой. Добавляют 1−2 мл 96%-ного этилового спирта, 1 мл конц. серной кислоты. После охлаждения пробирки обнаруживают ананасный запах
образовавшегося масляно-этилового эфира.
Для обнаружения гранулезы в клетках маслянокислых бактерий
на каплю культуральной жидкости с бактериями наносят на 5−10 мин
каплю конц. раствора Люголя, после чего накрывают покровным
стеклом и микроскопируют. Гранулеза окрашивается в темнокоричневый цвет.
Оформление и анализ результатов исследований
1. Получить накопительную культуру молочнокислых бактерий
из кефира, кислого молока, описать характер роста. Приготовить препарат фиксированных клеток, промикроскопировать (объектив 90х).
Рассмотреть и зарисовать микроскопические картины исследованных
культур. Под каждым рисунком подписать увеличение препарата.
49
50
2. Получить накопительную культуру маслянокислых бактерий,
описать характер роста. Приготовить препарат фиксированных клеток, промикроскопировать (объектив 90х). Рассмотреть и зарисовать
микроскопические картины исследованных культур. Под каждым рисунком подписать увеличение препарата.
В ходе изучения данной темы студенты научатся получать
накопительную культуру молочнокислых и маслянокислых бактерий
и закрепят методы исследования микробиологических объектов,
необходимые для их профессиональной деятельности.
Контрольные вопросы
1. Что такое молочнокислое брожение, и какое значение оно имеет для
молочнокислых бактерий?
2. Какую форму имеют клетки молочнокислых бактерий?
3. Какой тип питания и дыхания у молочнокислых бактерий?
4. Одинакова ли оптимальная температура развития различных молочно-
кислых бактерий?
5. Какие условия постановки опыта способствуют накоплению молочно-
кислых бактерий, и чем ограничивается развитие посторонней микрофлоры?
6. Каково практическое использование молочнокислых бактерий?
7. Что такое маслянокислое брожение, и каково его значение для масляно-
кислых бактерий?
8. Какую форму имеют клетки маслянокислых бактерий, и образуют ли они
споры?
9. Каков тип питания и дыхания маслянокислых бактерий?
10. Как обнаружить наличие в опыте маслянокислых бактерий и продуктов
их жизнедеятельности? Подтвердить уравнениями реакций.
11. Какие условия постановки опыта способствуют накоплению масляно-
кислых бактерий?
12. Каково практическое использование маслянокислых бактерий?
13. Какие еще виды брожения Вы знаете? Какой биологический смысл име-
ет процесс брожения для жизнедеятельности микроорганизмов?
[1, с. 118–143; 3, с. 85–95; 6; 7; 8; 9, с. 10–20; 12, с. 10–20]
50
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]