Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Модуль «Клетка». Содержание лекций, контрольные вопросы, тесты. Методическое пособие
.pdf
2. Метод фиксации напряжения (voltage clamp).
Принципиальная схема установки для измерения ионных токов
методом фиксации мембранного потенциала [Рубин, 1989].
У2 – дифференциальный усилитель с высоким коэффициентом усиления;
Hа один вход усилителя подается pазность потенциалов между измеpительным микpоэлектpодом Эи и наpужным электpодом сpавнения Эс, т.е. мембpанный потенциал клетки, котоpый измеpяется усилителем У1. Hа
втоpой вход усилителя У2 поступает командный потенциал ϕ. Если командный потенциал ϕ pавен потенциалу
покоя мембpаны ϕМ, напpяжение на выходе диффеpенциального усилителя pавно нулю, пpи этом в цепи, включающей токовый микроэлектpод Эт, клеточную мембpану и
электpод сpавнения, тока нет. Если командный потенциал отличается от потенциала покоя, на выходе диффеpенциального усилителя возникает напpяжение пpопоpциональное pазности потенциалов (ϕ-ϕМ). В этом случае по
цепи обpатной связи чеpез токовый микpоэлектpод Эт,
клеточную мембpану и электpод сpавнения Эс потечет
электpический ток, который сместит потенциал на мембране, приближая его к заданному значению потенциала
Первоначально проводится так же, как patch-clamp,
но пропускают ток противоположный по знаку, но равный по абсолютной величине ионному току. В результате
трансмембранная разность потенциалов не изменяется.
Это дает возможность изучить ионный ток.
61
3. «Русский метод».
Это модификация patch-clamp. Отличие лишь в том,
что добавляют различные фармакологические препараты
и блокаторы ИК, затем смотрят результат.
Общая физиология возбудимых тканей.
1. Открытие животного электричества.
1. Наблюдение биоэлектрических явлений.
В конце XVIII века (1786 год) профессор анатомии
Болонского университета Луиджи Гальвани провел ряд
опытов, положивших начало целенаправленным исследованиям биоэлектрических явлений.
Первый опыт Гальвани.
Опыт состоит в том, что при соприкосновении нервно-мышечного препарата с биметаллическим пинцетом
наблюдается сокращение мышцы.
Готовят нервно-мышечный препарат из двух неразделенных задних лапок лягушки. Препарат обильно орошают раствором Рингера. Поднимают одну браншу биметаллического пинцета под корешки крестцового отдела
спинного мозга, не касаясь препарата другой браншей. В
случае соприкосновения второй бранши с мышцами бедра
лягушки возникает сокращение мышц всего препарата, частота которого соответствует частоте соприкосновений.
Гальвани высказал предположение о том, что сокращение мышц является следствием воздействия на них
электричества, источником которого выступают «животные ткани» – мышцы и нервы.
62
Однако другой итальянский исследователь – физик
и физиолог Вольта оспорил это заключение, по его мнению, причиной сокращения мышц был электрический
ток, возникающий в области контакта двух разнородных
материалов (медь и железо – гальваническая пара) с тканями лягушки.
С целью проверки своей гипотезы Л. Гальвани провел
второй опыт.
Второй опыт Гальвани.
Готовят препарат задней лапки лягушки с седалищным
нервом. Затем набрасывают седалищный нерв лягушки
на мышцу бедра так, чтобы он одновременно касался поврежденного и неповрежденного участков мышцы, и наблюдают сокращение мышц конечности.
Второй опыт Гальвани считается опытом, в котором
были получены абсолютные доказательства существования «животного электричества».
Опыт Маттеучи.
Готовят два нервно-мышечных препарата лягушки,
накладывают нерв второго препарата на мышцу первого;
ритмичное раздражение нерва первого препарата вызывает тетаническое сокращение обеих мышц.
2. Мембранная теория Ходжкина-Хаксли-Катца.
Мембранный потенциал.
Первые публикации о способе взаимодействия нервных клеток через специфические контакты, или синапсы, появились в 1893 году. Открытие синапсов связано с
именем испанского ученого Рамона-и-Кахала, который,
используя методику импрегнации нейронов серебром
Гольджи, обнаружил, что подавляющее большинство
нейронов имеют два функционально различных отростка:
дендрит и аксон.
63
Рамон-и-Кахал также нашел на поверхности дендритов небольшие выросты, которые назвал дендритными
шипиками, и выдвинул гипотезу, что места контактов
дендритных шипиков с аксонами представляют синапсы,
посредством которых осуществляется передача электрического импульса с аксона на дендрит.
Английские ученые Хаксли и Ходжкин в опытах на
кальмарах детально изучили механизм работы аксона,
который участвует в проведении электрических импульсов из тела нейрона либо к соседним нейронам, либо к
различным органам и тканям, например мышцам. Длина
аксонов может достигать десятков сантиметров. Диаметр
1 мм.
Аксон находится в морской воде. Один электрод погружают в аксон, другой – в морскую воду. Измеряют
ПП. Авторы погружали микроэлектрод на разную глубину аксона и установили, что величина ПП в разных точках
одинакова. Заряд внутри клетки является отрицательным
как абсолютно, так и относительно наружной поверхности КМ.
ϕкм
t
А – стимуляция аксона электрическим стимулом прямоугольной
формы; Б – форма потенциала действия, зарегистрированная в
данном опыте. 1 – аксон; 2 – активный электрод; 3 – электрод
сравнения; 4 – усилитель. Стрелками показано направление
распространения возбуждения.
В 1952 году Хаксли и Ходжкин создали математическую модель, увязывающую потенциал действия с размером аксона, а в 1963 получили за исследование Нобелев-
64
скую премию (совместно с австралийским физиологом
Эклсом).
Хаксли исследовал синапсы нервных волокон и физико-химические изменения при передаче нервного импульса, ионные механизмы возбуждения и торможения в
нервной системе. Ходжкин теоретически и экспериментально доказал, что возникновение биопотенциалов связано с избирательной проницаемостью клеточной мембраны для ионов, разработал и применил оригинальный
метод фиксации потенциала на мембране для исследования механизма потенциала действия в нервном волокне.
Эклс внес важный вклад в изучение ионных механизмов
возбуждения и торможения
Согласно мембранно-ионной теории (теория Ходжкина-Хаксли-Катца, 1952 г.) непосредственной причиной
потенциала покоя (ПП) является неодинаковая концентрация анионов и катионов в клетке и вне клетки. В нервных и мышечных клетках концентрация калия в 30-40 раз
больше, чем вне клетки; концентрация натрия вне клетки
в 10-12 раз больше, чем в клетке. Хлора вне клетки в 30-50
раз больше, чем в клетке. В клетке имеется небольшое количество ионов магния. Кальций в свободном состоянии
в основном находится вне клетки. Он содержится еще
в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР), в гиалоплазме его мало, т.к. это обуславливается от части активным
транспортом кальция наружу через КМ, от части перемещением его ЭПР (резервуар кальция) и другими органеллами (митохондрии), связыванием кальция цитратом,
глутаматом.
В клетке есть отрицательные анионы (аспартат, органические фосфаты). Они не могут проходить через КМ
из-за больших размеров.
Ионы распределены неравномерно по обе стороны
КМ, т.к.:
1. Мембрана для различных ионов различно проницаема.
2. в результате работы ионных насосов, транспортирующих ионы в клетку и из клетки соответственно
концентрационному и электрическому градиентам.
65
Т.е. согласно мембранной теории биоэлектрические
потенциалы обусловлены неодинаковой концентрацией
ионов калия, натрия, хлора, кальция внутри и вне клетки и различной проницаемостью мембраны для них.
Суть теории:
Все клетки имеют электрический заряд, обеспечиваемый неодинаковой концентрацией анионов и катионов
внутри и вне клетки. Различная концентрация анионов и
катионов внутри и вне клетки является следствием работы ионных насосов и неодинаковой проницаемости КМ
для различных ионов. Однако свойства КМ возбудимых
клеток существенно отличается от таковых невозбудимых
клеток. При действии раздражителя на клетку возбудимой
ткани изменяется проницаемость ее КМ (вначале, как
правило, очень быстро изменяется проницаемость КМ
для ионов натрия и быстро возвращается к норме и более
медленно несколько позже повышается проницаемость
для ионов калия и так же более медленно возвращается
к норме). Вследствие чего ионы быстро перемещаются
согласно электрохимическому градиенту (совокупность
концентрационного и электрического градиентов) – это
и есть процесс возбуждения. Его основой является ПП
(мембранный потенциал). Движущей силой для ионов
является электрохимический градиент, а условием движения ионов – увеличение проницаемости КМ.
Регистрация биоэлектрических явлений (ПП и ПД).
Впервые регистрация была осуществлена с помощью
гальванометра, одна их клемм которого присоединялась к
поврежденному участку мышцы, другая – к неповрежденному (Маттеучи, 1838 г), при этом стрелка гальванометра
отклонялась. Размыкание цепи гальванометра сопровождалось возвращением стрелки гальванометра в прежнее
(нулевое) положение.
В настоящее время существует много различных вариантов регистрации биоэлектрических явлений, но их
можно объединить в две основные группы:
1. По местоположению (внутриклеточные и внекле-
точные).
66
2. По числу отводящих электродов (монополярные,
биполярные, мультиполярные).
Электроды могут быть стеклянными и металлическими.
В случае монополярного отведения один электрод активные, второй – индифферентный, его площадь в десятки раз больше активного электрода.
При внутриклеточном отведении применяется сте-
клянный микроэлектрод, который представляет собой
микропипетку с диаметром кончика 0,5-1 мкм. Микроэлектрод заполняется 3 М КCl. В широкую часть
микроэлектрода вставляется серебряная проволочка,
соединяемая с регистрирующим устройством. Индифферентным клеточным электродом является хлорированная серебряная пластинка. При внутриклеточном
отведении клетка способна функционировать в течение
нескольких часов.
Микроэлектродный способ регистрации биопотенциалов обеспечил изучение механизмов создания электрических зарядов клеткой, возникновения возбуждения в
живых клетках. Однако еще задолго до появления микроэлектродной техники (конец XIX в.) стало ясно, что «животное электричество» обусловлено процессами, происходящими на КМ (Герман, Дюбуа-Реймон, Бернштейн).
В настоящее время достаточно хорошо изучены механизмы формирования ПП и ПД, т.е. процесса возбуждения
клетки.
Регистрация ПП.
Пока микроэлектрод не проник в клетку, разности потенциалов между двумя электродами нет (регистрируется
нуль). Когда микроэлектрод проходит в клетку регистрируется разность потенциалов. При этом за мембранный
потенциал принимают потенциал внутренней поверхности относительно наружной, т.е. потенциал покоя (ПП)
или мембранный потенциал (МП) – это трансмембранный
потенциал (разность электрических потенциалов) между
двумя прилегающими к плазмолемме водными фазами
(внутриклеточной и внеклеточной), регистрируемый до
начала действия раздражителя.
67
Величина ПП довольно вариабельна. Для эритроцитов он равен –10 мВ, для скелетных мышц –90 мВ, для
нервных клеток – 80мВ, для волокон Пуркинье сердца
–100мВ.
Непосредственной причиной ПП является различная
концентрация анионов и катионов по обе стороны мембраны. Почему же ионы так расположены? Во-первых,
КМ различно проницаема для различных ионов (в покое
проницаемость для калия в 25 раз больше проницаемости
для натрия, т.к. много «каналов утечки»; крупномолекулярные анионы вообще не выходят из клетки, т.к. для них
КМ не проницаема. Во-вторых, разность концентрации
анионов и катионов внутри и вне клетки поддерживается
наличием постоянно работающих ионных помп – белковые молекулы – натрий калиевая пампа – АТФ-аза.
Ионные механизмы формирования ПП.
В состоянии покоя калий выходит из клетки, натрий
заходит в клетку. В этом состоянии клетка внутри заряжена отрицательно, а снаружи положительно. Ионы калия
выходят из клетки против концентрационного градиента,
выносят с собой положительные заряды и заряжают наружную поверхность КМ положительно. Внутри клетки
остается избыток отрицательных анионов, которые создают отрицательный заряд на внутренней поверхности мембраны. При чем этот отрицательный заряд во всех точках
клетки практически одинаков. Об этом свидетельствует
одинаковая величина ПП при введении микроэлектрода
на разную глубину внутрь клетки, как это было в опытах
Ходжкина, Хаксли, Катца на гигантском аксоне кальма-
68
ра. По мере того как на наружной поверхности мембраны
клетки накапливается положительный заряд, формируется электрический градиент, направленный внутрь клетки
(т.е. препятствующий дальнейшему выходу ионов калия).
Этот процесс продолжается до тех пор, пока не установится МП, т.е. разность потенциалов между наружной и
внутренней поверхностью КМ.
Следовательно, калий – основной ион формирования
ПП. Об этот свидетельствуют результаты опыта с перфу-
зией внутреннего содержимого гигантского аксона кальмара
солевыми растворами. При уменьшении концентрации
калия в перфузате ПП уменьшается, при увеличении –
увеличивается.
В покоящейся клетке устанавливается динамическое
равновесие между числом входящих в клетку ионов калия
и выходящих из клетки ионов калия. Электрический и концентрационный градиенты противодействуют друг другу:
согласно концентрационному градиенту калий стремится
выйти из клетки, отрицательный заряд внутри клетки и
положительный снаружи препятствуют этому. Когда концентрационный и электрический градиенты уравновесят
друг друга, число выходящих из клетки ионов калия станет рано числу входящих в клетку ионов калия, это ведет к
формированию равновесного калиевого потенциала.
Равновесный потенциал – это такой МП, при котором
концентрационный и электрический градиенты равны
друг другу, но противоположны по направлению, в результате суммарная движущая сила для диффузии ионов
равна нулю, следовательно, поток ионов через КМ прекращается.
ϕк – равновесный потенциал для калия.
ϕNa – равновесный потенциал для натрия.
Равновесный потенциал для любого иона можно рассчитать по формуле Нернста (уравнение Нернста):
RT
ϕ
=
рав
ZF [C]
где
ϕ
– равновесный потенциал, создаваемый данным
рав
• ln
[C]
o
i
ионом.
69
[C]o и [C]i – внешняя и внутренняя концентрация ионов соответственно;
R – универсальная газовая постоянная;
Т – абсолютная температура;
F – постоянная Фарадея;
Z – валентность.
Равновесный потенциал для ионов калия равен –97
мВ, но реально ПП для миоцита несколько меньше –90
мВ для теплокровных животных, т.к. в его формировании
принимают участие и другие ионы.
Роль ионов натрия и хлора в формировании ПП:
Проницаемость КМ в покое для натрия меньше, чем
для калия, но она есть. Следовательно, натрий согласно
концентрационному и электрическому градиентам стремится и в небольшом количестве проходит внутрь клетки,
следовательно, уменьшается ПП, т.к. на внешней поверхности КМ суммарное число положительно заряженных
ионов уменьшается, а часть отрицательных ионов внутри
клетки нейтрализуется входящими в клетку положительно заряженными ионами натрия. В результате входящий
в клетку натрий уменьшает ПП.
Влияние ионов хлора противоположно натрию и зависит от проницаемости КМ (она в 2 раза меньше, чем
для калия). Хлор согласно концентрационному градиенту
стремится и проходит в клетку. Препятствует входу хлора в клетку электрический градиент, т.к. хлор – отрицательно заряженный ион, и в клетке тоже отрицательный
заряд. Следовательно, наступает равновесие сил концентрационного градиента, способствующего входу хлора
в клетку, и электрического градиента, препятствующего входу хлора в клетку. Поэтому концентрация хлора в
клетке 5-10 ммоль\л, вне клетки – 120-130 ммоль\л. При
поступлении хлора внутрь клетки число отрицательных
зарядов вне клетки уменьшается, а внутри клетки увеличивается. В результате совместно с имеющимися в клетке
отрицательными анионами хлор увеличивает ПП.
Частично, как и вне клетки, ионы натрия и хлора внутри клетки нейтрализуют друг друга. Следовательно, со-
70
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]