Добавил:

ivanov666 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Башкирский Государственный Аграрный Университет

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

Модуль «Клетка». Содержание лекций, контрольные вопросы, тесты. Методическое пособие

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

07.09.2026

Размер:

1 Мб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 56 / 156 7 8 9 10 11 12 13 14 15 > Следующая >>>

наличию у нее специализированных структур (например, для палочек и колбочек сетчатки – лучи солнечного света);

2) неадекватные – раздражители, к которым клетка

обладает наименьшей чувствительностью, из-за отсутствия у нее специализированных структур (например, мышечное сокращение под воздействием кислоты или щелочи).

В эксперименте весьма часто используют электриче-

ский раздражитель, так как его просто дозировать.

Электрический раздражитель имеет следующие осо-

бенности:

1. Универсальность.

2. Простота дозировки по силе, длительности, крутиз-

не нарастания и частоте стимулов.

3. Простота включения и выключения. Электрический раздражитель часто используют в кли-

нической практике, как с диагностической, так и с лечебной целью.

2. Возбудимость – это свойство специализированных

тканей (нервная, мышечная, железистая) генерировать потенциал действия (ПД) на раздражение.

Возбуждение – это процесс электрического, сокра-

тительного или железистого ответа специализированной ткани.

Возбуждение – это частный случай раздражения. Принципиальное отличие возбудимой и невозбудимой

тканей в том, что возбудимая ткань способна генерировать ПД.

К возбудимым тканям относятся: мышечная, нервная,

железистая; к невозбудимым – костная, эпителиальная, соединительная.

3. Проводимость – это способность ткани и клетки

передавать возбуждение.

4. Сократимость – присуща мышечной ткани/клетке и

выражается в изменении ее длины и/или напряжении.

Микроэлектродная техника

Микроэлектродная техника в физиологии, применяет-

ся для измерения электрических, концентрационных и окислительных потенциалов различных клеток и их частей, а также для местного, строго ограниченного воздействия на них током и различными веществами.

Микроэлектроды введены в 1946 американскими учё-

ными Р. Джерардом и Дж. Лингом и стали применяться для отведения электрических потенциалов сначала от одиночного мышечного волокна, а затем и от отдельной клетки.

В лабораторных исследованиях используются метал-

лические микроэлектроды с диаметром кончика порядка 1 мкм, заполненные раствором электролита (КСl) стеклянные микропипетки с диаметром кончика меньше 1 мкм (0,5 мкм), погруженной в него хлорированной серебряной проволокой и некоторые другие типы микроэлектродов. Для подведения их к объекту применяют микро-

манипуляторы.

Микроэлектрод InLab Micro

На схеме показан микроэлектрод в гигантском аксоне

кальмара Он заполненный раствором KCl.

Микроэлектрод в нейроне

1 – синапсы; 2 – аксон;

3 – микроэлектрод

Постановка эксперимента по регистрации ответов в

зрительной системе. Животное (обычно это макак) помещают

перед экраном, на который

проецируется стимул.

Регистрацию осуществляют,

вводя микроэлектрод в тот или

иной участок зрительного пути,

в данном случае в первичную

зрительную кору. (На рисунке

изображен мозг человека, но мозг

обезьяны очень сходен с ним.)

Конструкции ионоселективных электродов и полевых

транзисторов. (а) Мембранный электрод с внутренним

жидкостным контактом; (б) мембранный электрод с твердым

контактом; (в) микроэлектрод с жидкой мембраной; (г)

тонкопленочный электрод с полимерной мембраной; (д) электрод

с газовым зазором; (е) ионоселективнй полевой транзистор.

1 – ионоселективная мембрана; 2 – внутренний стандартный

раствор 3 – токосъемник (внутренний электрод сравнения);

4 – рН-метрический стеклянный электрод; 5 – солевой мостик

к электроду сравнения; 6 – сток и исток; 7 – изолирующий

материал (диоксид кремния); 8 – кремниевое основание;

9 – электрод сравнения

Схема измерений мембранного потенциала покоя с помощью

внутриклеточного стеклянного микроэлектрода (М). Второй

электрод (И) помещен в омывающую клетку жидкость.

Комплект для полевых измерений с микроэлектродом

Существуют «виртуальные электроды». В 1989 г. группой проф. John Wikswo был выполнен

ряд экспериментов с точечной электростимуляцией плоской двумерной модели сердечной ткани. Было показано, что после приложения точечного стимула вблизи стимулирующего электрода образуются характерная картина смежных областей деполяризации и гиперполяризации как результат неравной анизотропии вне- и внутриклеточного пространств.

Виртуальные электроды при точечной

электростимуляции миокарда.

А – центральный виртуальный катод (VC) и виртуальные аноды

(VA) при электростимуляции катодным током в двумерной бидоменной модели; B – виртуальные электроды при электростимуляции анодным током в двумерной бидоменной модели; C – экспери-

ментальная картина распределения трансмембранной поляризации

на поверхности эпикарда при катодной ЭС; D – эксперименталь-

ная картина, соответствующая анодной электростимуляции.

(Заимствовано из публикации И.Р.Ефимова, А.Т.Самбелашвили,

В.Н.Никольского «Прогресс в изучении механизмов в электриче-

ской стимуляции сердца», Вестник аритмологии, 2002 г., N 27).

Этой характерной формы области поляризации в виде «собачьей кости» (dog-bone shape) не наблюдается в случае, если отношения проводимостей для этих внутри- и внеклеточного пространств одинаковое (случай равной анизотропии обоих пространств) – точка электростимуляции тогда просто окружена эллипсом равномерно спадающей деполяризации/гиперполяризации при катодном/анодном стимуле.

Таким образом, неравная анизотропия двух пространств обусловливает образование смежных областей противоположной поляризации, получивших название

виртуальных анодов (гиперполяризация) и виртуальных катодов (деполяризация). Это определение виртуальных

электродов справедливо для стимуляции электрически-

ми полями любой пространственной конфигурации, а не только при точечной электростимуляции. Положительная часть функции активации соответствует виртуальному катоду, так как она приводит к деполяризации, в то время как отрицательная часть функции активации соответствует виртуальному аноду, вызывающему гиперполяризацию.

Гипотеза виртуальных электродов получила блестящее подтверждение в экспериментах с использованием флуоресцентных красителей для картирования трансмембранного потенциала на поверхности эпикарда во время монополярной и биполярной электростимуляции

Виртуальные электроды при биполярной ЭС миокарда.

Распределение трансмембранного потенциала на поверхности

сердца кролика было записано с помощью флуоресцентного

красителя di-4-ANEPPS и системы оптического картирования.

Положение анода и катода отмечено знаками + и –

соответственно. (Заимствовано из публикации И.Р.Ефимова,

А.Т.Самбелашвили, В.Н.Никольского «Прогресс в изучении

механизмов в электрической стимуляции сердца», Вестник

аритмологии, 2002 г., N 27).

Этот совместный успех бидоменной модели и флуоресцентной техники дал толчок интенсивным исследованиям кардиоэлектростимуляции и дефибрилляции в рамках данной концепции. В частности, было показано теоретически, что для пассивной модели геометрия виртуальных электродов не зависит от силы тока, а определяется лишь значениями проводимостей, характеризующих среду.

Таким образом, гипотеза «виртуальных электродов», известная также под названием «гипотеза поляризации виртуального электрода», описывает комплексную глобальную поляризацию миокарда, характеризующуюся одновременным наличием областей положительного и отрицательного зарядов, которые прилежат друг к другу. В свете этой гипотезы становятся понятными причины неудачной дефибрилляции и возникновения новой аритмии по механизму re-entry, индуцированной приложенным разрядом. После дефибрилляционного шока в результате проявления эффекта виртуальных электродов длительность потенциала действия и рефрактерного периода действительно удлиняются в некоторых областях поверхности сердца, но одновременно укорачиваться в других. Эти области соответствуют зонам положительной и отрицательной поляризации во время действия стимула. Следовательно, виртуальные электроды порождают неоднородную реполяризацию, способную препятствовать успешной дефибрилляции путём индуцирования новой аритмии по механизму re-entry.

Методы изучения отдельных ионных

каналов

1. Метод локальной фиксации потенциала (patch clamp).

Метод patch-clamp позволяет осуществлять локальную (точечную) фиксацию мембранного потенциала и измерять токи через одиночные ионные каналы. На данный момент этот метод является мощным средством для исследования биомембран.

Метод позволяет:

1. проводить многие исследования в рамках классиче-

ских электрофизиологических подходов.

2. регистрировать токи и потенциалы от клеток очень

малых размеров (3-10 мкм)

3. регистрировать токи одиночных каналов амплиту-

дой порядка пикоампер

4. исследовать действие лекарственных препаратов при быстром подведении их как к наружной, так и к внутренней стороне мембраны

Метод пэтч-кламп был введен в исследовательскую практику Неером и Сакманом, когда в 1976 году ими была опубликована статья в журнале «Nature», которая называлась «Токи через одиночные каналы в мембране волокна денервированной мышцы лягушки». Это открыло путь для изучения на молекулярном уровне электрических свойств мембран и регуляции различных транспортных процессов.

Рatch-clamp (англ. patch – заплатка, clamp – здесь: захват, фиксация) – к мембране подводят микроэлектродприсоску (внутри его создается разряжение) и если на этом участке оказывается канал, исследуют ионный ток через него. ПП с помощью подачи электрического напряжения изменяют и фиксируют на определенном уровне, затем клеточную мембрану градуально деполяризуют, что ведет к открытию ионных каналов и возникновению ионного тока, который мог бы деполяризовать клетку. Однако при этом пропускается электрический ток, равный по величине, но противоположный по знаку ионному току, поэтому трансмембранная разность потенциалов не изменяется. Это дает возможность изучить величину ионного тока через мембрану. В этом случае применяют специфические блокаторы ионных каналов

Схема patch-clamp

Основой для создания метода послужило обнаружение факта, что при определённых условиях клеточная мембрана формирует очень плотный контакт с поверхностью кончика стеклянного микроэлектрода. При небольшом разрежении, создаваемом внутри пипетки, между стеклом и мембранным фрагментом возникает контакт, имеющий гигаомное сопротивление. В результате образуется электрически изолированный участок мембраны, и шум регистрирующего сигнала уменьшается на несколько порядков. Так как контакт мембраны со стеклом очень прочен, то находящийся под кончиком электрода фрагмент надо либо изолировать от клетки, либо разрушить, и таким образом проникнуть внутрь клетки. Существует несколько вариантов метода patch-clamp (рис. 2).

Наиболее близким к естественным условиям является вариант измерения ионных токов на прикреплённой, но неповрежденной клетке, поскольку исследуемый участок мембраны не отделяется от клетки и не нарушается его связь с цитоплазмой. Измерение на целой клетке при разрушении мембраны в кончике микропипетки (whole-cell) позволяет заменять ионный состав цитоплазмы и изучать на диализированных таким образом клетках ионные токи в режиме фиксации напряжения.

Ионные токи через небольшие мембранные фрагменты измеряют с помощью пипеток, у которых диаметр кончика соизмерим с размерами фрагментов. Сопротивление пипеток, заполненных раствором 150 ммоль/л KCl и погружен-

ных в раствор такой же концентрации, приблизительно линейно зависит от площади отверстия кончика и варьирует от 1 до 5 МОм. Площадь отверстия кончика пипетки можно варьировать от 1 до 8 мкм2, изменяя степень нагрева спирали на последнем этапе вытягивания. Эти размеры находятся на грани разрешения светового микроскопа. Наружную поверхность покрывают гидрофобным материалом – силгардовой резиной. Особенностью незастывшего силгарда является его способность растекаться тонкой пленкой по поверхности стекла на несколько миллиметров, покрывая при этом и кончик микроэлектрода. Так как высокоомные контакты образуются только с чистым стеклом, эту пленку необходимо удалять только оплавлением микроэлектродов. При работе на мембранных фрагментах используется несколько типов пипеток.

Пипетки из тугоплавкого стекла получили в практике большее применение, чем пипетки из мягкого стекла. Первые имеют больше удельное сопротивление, чем мягкое стекло с более низкой температурой плавления. Вследствие этого вклад шума, обусловленного ёмкостью связи через стеклянную стенку в пипетках с тугоплавким стеклом меньше.

Пипетки из толстостенного тугоплавкого стекла имеют ряд преимуществ. Во-первых, при большей толщине стенок шунтирующая проводимость через стекло меньше. Во-вторых, на некоторых препаратах гигаомные контакты более стабильны и величина их образования значительно больше, чем для аналогичных тонкостенных пипеток

Блок управления patch-clamp установкой. На мониторе видна

пипетка, касающаяся поверхности клетки. Cell-attached mode.

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 56 / 156 7 8 9 10 11 12 13 14 15 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]