Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Микробиология. Учебно-методическое пособие для проведения лабораторных работ
.pdf
пыльной головней зерновых, ложномучнистой росой лука, плодовой гнилью
яблок, дырчатой пятнистостью косточковых, мозаикой листьев картофеля,
свеклы, гнилями корнеплодов, малины, монилиозом, корневым раком плодовых,
мумификацией плодов яблок, «ведьмиными метлами» плодовых или ягодников;
зараженные фузариозом, гельминтоспориозом семена зерновых. Чистые культуры родов Fusarium, Alternaria и др. грибов на питательных средах.
Ход работы
На лабораторных занятиях ознакомление с симптомами поражения начинают с внешнего осмотра больного и здорового растения. Затем определяют
типы болезней по ключу следующим образом. Читают первый пункт (тезу) и,
если он не противоречит характерным признакам поражения, смотрят следующий пункт. Если признаки не совпадают с описанными, переходят к пункту,
номер которого стоит в скобках, т. е. к антитезе. Таким образом, изучают ключ
до тех пор, пока не будет найдено название типа болезни.
Ключ для определения типов болезней
1 (4). Поражено все растение.
2 (3). Растение угнетено. Вследствие потери тургора отмечается пожелте-
ние и увядание. Причинами могут быть закупорка сосудистой системы микроорганизмами, поражение корневой системы, недостаток влаги в почве, поражение высшими цветковыми паразитами, механические повреждения, отравление
токсинами ............... Увядание.
3 (2). Растение деформировано, отмечается увеличенное количество укороченных стеблей, на всем растении могут быть укороченные или морщини-
стые листья ............... Общая деформация.
4 (1). Поражены отдельные органы растений.
5 (8). На пораженных частях растений отмирающие участки ткани или от-
дельные органы изменили свою форму.
6 (7). На листьях, реже на других органах наблюдается отмирание отдельных
участков тканей или уменьшение хлорофилла в зеленых органах растений. На ор-
61
ганах, богатых питательными веществами и водой, отмирание захватывает только
поверхностные слои ткани, не распространяясь вглубь ...............
Пятнистости.
7 (5). Изменение формы пораженных органов растений. Могут отмечаться
уродливость, деревянистость, израстание и другие формы ...............
Деформация.
8 (11). Пораженные органы покрыты бугорками или плесенями.
9 (10). На вегетативных или генеративных органах серая, белая, бурая, ко-
ричневая или черная, легко стирающаяся плесень (спороносящий мицелий),
эпидермис под ней без повреждений ............... Налеты.
10 (8). На пораженных органах – бугорки (подушечки), содержащие спороносящие органы и споры грибов, покрытые эпидермисом или выступающие
из трещин ткани растений; бугорки могут иметь желтую, бурую, оранжевую,
коричневую, черную окраску ...............
Пустулы.
11(14). Пораженные органы размягчаются или ненормально разрастаются.
12 (13). Органы, богатые питательными веществами и водой (корнеплоды,
плоды, стебли, клубни и др.), размягчаются и загнивают. Поражение может за-
хватывать все ткани, распространяясь в глубь органа ...............
Гнили.
13 (11). Ненормальное разрастание отдельных органов растений различной
величины и формы ............... Наросты.
14(8). Другие симптомы поражения.
15 (16). Пораженные органы превращаются в твердые, темные, кожистые
образования или черную пылящую массу, из больных частей растений выделяется жидкость, твердеющая на воздухе.
16 (17). Плоды или семена превращаются в темные плотные образования
черного цвета с гладкой или шероховатой поверхностью ............... Мумификация.
17 (18). Пораженные органы (зерна, стебли, листья) разрушаются и превра-
щаются в порошковидную массу черного или коричневого цвета ............... Пыля-
щие массы (головня).
18 (14). На больных растениях образуются трещины, из которых выделяется
жидкость, твердеющая на воздухе ............... Камедетечение.
Определив тип поражения, необходимо уточнить симптомы болезни.
62
При грибных пятнистостях на отмерших участках появляются спороношения в виде ложных налетов, подушечек, темных или другого цвета “точек” – плодовых тел.
При пятнистостях, вызываемых бактериями, часто заметна маслянистость,
а в местах поражения можно увидеть капельки жидкости – бактериальный
экссудат.
Пятнистость, при которой отмечается чередование темно-зеленых и светлозеленых участков, носит название мозаики, в основном, она вызывается вирусами.
Виды гнилей: сухая – пораженный орган становится твердым, деревянистым,
ткань крошится; мокрая – орган размягчается, но форма сохраняется; мягкая – пораженная ткань превращается в однородную массу сметанообразной консистенции, часто сопровождается неприятным специфическим запахом.
Налеты различают двух типов: настоящие, представленные мицелием, бесполым спороношением и плодовыми телами грибов, ложные, состоящие только из
бесполого спороношения. С настоящим налетом знакомятся на примере мучнистой
росы дуба, с ложным – макроспориоза томатов.
63
Лабораторная работа № 11
ИЗУЧЕНИЕ АНТАГОНИЗМА МИКРООРГАНИЗМОВ
В различных почвах встречается большое количество микроорганизмовантагонистов, особенно среди актиномицетов и бактерий. Подтверждением
этому служит то обстоятельство, что подавляющее большинство используемых
в медицине антибиотиков получают из актиномицетов. В естественных условиях антибиотические вещества имеют большое значение в борьбе с конкурентными организмами. Существуют различные методы выделения антагонистов из почвы.
Нанесение тест-культуры на поверхность колоний, выросших на ага-
ровой пластинке
Методом разведений, применяемым для культивирования и количественного определения почвенных микроорганизмов, проводят посев культур. После инкубации выбирают пластинки, на которых колонии различных
микроорганизмов не сливаются; целесообразно отбирать пластинки с числом
колоний не более 20. В соответствии с техникой точечного тестирования тестовую культуру смешивают с 6–8 мл жидкого агара с температурой 50 °С и наносят смесь на поверхность колоний. Чашки с застывшим агаром помещают в холодильник при 10 °С и лишь спустя 10 часов переносят в термостат, поддерживающий температуру 28 °С. После инкубации в течение 1–2 суток определяют
колонии, угнетающие рост тестового микроорганизма. Материал этих колоний
пересевают и освобождают от сопутствующей микрофлоры. Синтез антибиотиков в значительной степени зависит от состава питательной среды, поэтому рекомендуется культивировать микроорганизмы-антагонисты на средах, благоприятствующих их продуцированию. Актиномицеты активно синтезируют антибиотики на модифицированном Коном глицерин-аспарагиновом агаре, а грибы – на питательной среде Викерхэма.
Выделение антибиотиков бактериями можно успешно изучать на питательной среде Гаузе.
64
Определение наименьшей бактериостатической концентрации
антибиотиков
Определенное количество исследуемого антибиотика (10–100 мг в зависимости от его особенностей) растворяют в 10 мл стерильной дистиллированной
воды. Из основного раствора готовят серию разведений с таким расчетом, чтобы в каждом последующем разведении содержание антибиотика было в два раза меньше, чем в предыдущем; для этого 5 мл раствора антибиотика каждого
разведения смешивают с 5 мл стерильной дистиллированной воды. Получают
не менее 10, а в случае необходимости и больше разведений.
Одновременно с приготовлением серии разведений готовят соответствующее число агаровых пластинок, в которые еще до застывания агара вводят
тестовый микроорганизм. В каждой из пластинок вырезают по четыре отверстия, в стерильных условиях удаляют диски и в отверстия вносят по 0,2 мл раствора каждого разведения. Таким образом, для всех разведений ставят по
четыре параллельных опыта. Чашки устанавливают в холодильник при 10 °С
и спустя 10 часов переносят их в термостат с температурой 28 °С. Инкубация
длится 24 часа, после чего оценивают результаты опыта. Бактериостатическим
па отношению к тестовому микроорганизму признается то наибольшее разведение, при котором вокруг отверстия в агаровой пластинке еще можно обнаружить зону задержки роста. Минимальную бактериостатическую концентрацию
антибиотика выражают в микрограммах на 1 мл раствора. При проведении этого исследования вместо вырезания отверстий в агаре можно пользоваться отрезками трубочек; их устанавливают на поверхности агаровой пластинки с тестовой культурой и вносят соответствующую дозу антибиотика.
Определение чувствительности целлюлозных бактерий к анти-
биотикам
Подавляющее большинство целлюлозных бактерий размножаются только
на питательных средах, содержащих целлюлозу. Следовательно, для изучения
их чувствительности к антибиотикам обычные методы непригодны. При участии автора был разработан метод, позволяющий проводить исследования тако-
65
го рода. На основе 1,5 %-го агара Бакто готовят так называемый водный агар,
не содержащий питательных солей, разливают его в чашки Петри и дают ему
застыть.
Из качественной фильтровальной бумаги вырезают диски диаметром
35 мм и стерилизуют их 12 часов при 105 °С. Более высокая температура
непригодна, так как обожженная фильтровальная бумага менее доступна
для бактерий.
На поверхности агаровой пластинки равномерно размещают четыре бумажных диска с расстоянием между ними не менее 10 мм, на каждый диск
наносят 0,2 мл питательной среды Виноградского и 0,1 мл взвеси целлюлозных
бактерий. Сразу же после этого в центр каждого диска укладывают готовый бумажный кружок, содержащий антибиотик. Чашки Петри помещают в термостат
и при 28 °С инкубируют в течение нескольких суток. Во избежание высыхания
агаровой пластинки в инкубационной камере рекомендуется установить открытый сосуд с водой. Через несколько суток вокруг содержащего антибиотик бумажного диска видна задержка роста культуры, выраженная в отсутствии
окраски и сохранении структуры фильтровальной бумаги.
Этот же, но несколько модифицированный метод пригоден для исследования жидких антибиотических препаратов. В центре бумажного диска вырезают отверстие диаметром 10 мм и такие же отверстия готовят в агаровой
пластинке, используя для этого сверло для пробок. Жидкие субстраты исследуют методом лунок.
Приближенное определение содержания антибиотика в культуральной жидкости
Метод агаровых пластинок
Данный метод пригоден в том случае, когда известна химическая структура антибиотика в культуральной жидкости. Именно поэтому он нашел наиболее
широкое применение для примерной оценки количества антибиотика, накопившегося в ферментере. Метод агаровых пластинок основан на сравнении
диаметров зон угнетения, образованных взятым из питательной среды натив-
66
ным антибиотиком, и чистым препаратом антибиотика. Поскольку между диаметрами зон, образованных препаратом антибиотика, и его содержанием существует логарифмическая зависимость, надежные результаты можно получить
лишь при тестировании небольшими дозами антибиотика. В частности, в опытах со стрептомицином, где в качестве тест-культуры служит Вас. mycohdes,
допустимое содержание антибиотика составляет 1,5; 1,4; 1,3; 1,2; 1,1; 1,0; 0,9;
0,8; 0,7 и 0,6 ед/мл. Для других антибиотиков дозы могут быть иными.
Получив серию разведений чистого препарата антибиотика, равные объемы материала каждого разведения вносят в отверстия или трубочки на поверхности агаровой пластинки, засеянной тестовым микроорганизмом. Чашки
Петри помещают в холодильник, а спустя 10 часов переносят в термостат
с температурой 28 °С. После 24-часовой инкубации измеряют диаметр зон
угнетения роста и на основании полученных данных на миллиметровой бумаге
вычерчивают калибровочную кривую. Затем готовят серию разведений культуральной жидкости, содержащей нативный антибиотик, и аналогичным образом проводят тестирование добавляя 3 мл жидкости к 1 мл стерильной дистиллированной воды.
Величины диаметров зон угнетения роста, полученные при тестировании нативных антибиотиков, соотносят с калибровочной кривой и таким
образом вычисляют примерное содержание антибиотика в 1 мл культуральной жидкости.
Для тестирования антибиотиков рекомендованы распространенные в международной практике испытанные штаммы тестовых микроорганизмов, которые можно получить из разных коллекций.
67
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В практикуме рассмотрены только некоторые лабораторные работы по
основным разделам общей микробиологии, которые позволяют студентам
ознакомиться с общими положениями и освоить технику микроскопирования
микроорганизмов, стерилизации, приготовления питательных сред, выделения чистых культур микроорганизмов, методы их культивирования и количественного учета.
Объем представленного издания позволяет рассмотреть некоторые достаточно важные и
современные методы исследования микроорганизмов.
При дальнейшем изучении общей микробиологии студентам следует помнить, что существуют другие подходы и методы в изучении микроорганизмов, очень тонкие методики и сложные схемы идентификации, разнообразные системы анализа.
В ХХ и в XXI веке с каждым последующим годом общая микробиоло-
гия, являясь фундаментальной наукой, все в
большей степени служит основой для многих прикладных дисциплин, таких как биотехнология, медицина,
ветеринария, сельскохозяйственные науки и т. д.
68
ЛИТЕРАТУРА
1. Гусев, М. В. Микробиология / М. В. Гусев, Л. А. Минеева. – М.:
Academa, 2003.
2.
Коротяев, А. И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусо-
логия / А. И. Коротяев, С. А. Бабичев. – СПб.: Спец. лит., 1998.
3.
Лабинская, А. С. Микробиология с техникой микробиологических ис-
следований / А. С. Лабинская. – М.: Медицина, 1978.
4.
Луста, К. А. Методы определения жизнеспособности микроорганизмов /
К. А. Луста, Б. А. Фихте. – Пущино, 1990.
5.
Определитель бактерий Берджи: В 2 т. / Пер. с англ. – М.: Мир, 1997. –
Т. 1.
6.
Практикум по микробиологии / Под ред. Н. С. Егорова. – М.: Изд-во
МГУ, 1995.
7.
Шлегель, Г. Общая микробиология / Г. Шлигель. – М.: Мир, 1987.
69
Учебное издание
ПЕСЦОВ Георгий Вячеславович,
ЖУКОВ
Николай Николаевич
МИКРОБИОЛОГИЯ
Учебно-методическое пособие
для проведения лабораторных работ
Публикуется в авторской редакции.
Минимальные системные требования:
Intel Celeron 1700 Mhz и
28 Мб RAM, 300 Мб на винчестере, ОС Microsoft Windows 7 и выше;
1
дисковод CD-ROM 2x и выше, SVGA 64 Mb; мышь.
Тульский государственный педагогический
университет им. Л. Н. Толстого.
300026, Тула, просп. Ленина, 125.
www.tsput.ru. E-mail: info@tsput.ru
Объем данных: 3,5 Мб.
выше,
Подписано к использованию: 26.11.2021.
Заказ 21/04
6. «С» 1911.
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]