Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Микробиология. Учебно-методическое пособие для проведения лабораторных работ
.pdf
Определение количества молочнокислых бактерий проводят глубинным
посевом на сусло-агаре с мелом или на капустном агаре с мелом, а также на капустном агаре со спиртом и мелом. Вокруг колоний молочнокислых бактерий
вследствие накопления молочной кислоты образуются зоны растворения мела.
Колонии молочнокислых бактерий на сусло-агаре с мелом и капустном
агаре с мелом подсчитывают на 5–6-е сутки, а на капустном агаре со спиртом
и мелом – на 7–10-е сутки. Среда 2 служит для выявления молочнокислых бактерий в составе эпифитной микрофлоры исходной растительной массы, так как
входящий в ее состав спирт тормозит рост посторонней микрофлоры.
Количество посторонней микрофлоры (аэробных гнилостных микроорганизмов) определяют глубинным посевом на пептонном агаре (среда 3). Подсчет
колоний ведут на 5–7-е сутки.
Количество микроскопических грибов и дрожжей определяют на суслоагаре со стрептомицином (среда 4) поверхностным посевом. Подсчет колоний
ведут на 3–4-е сутки, при необходимости повторно – на 7–8-е.
Титр маслянокилых бактерий устанавливают на жидкой среде Емцева
(среда 5а) и картофельной среде (среда 5). Для определения количества спор
маслянокислых бактерий делают посев из суспензии после ее пастеризации
в течение 10 мин при 75 °С. Учет ведут по интенсивности выделения газа (кусочки картофеля всплывают), титр маслянокислых бактерий и их спор устанавливают методом предельных разведений по Мак-Креди, а аэробные протеолитические бактерии учитывают на МПБ (среда 6) по накоплению газа в поплавках. Посевы выдерживают при 28 °С в течение 2 недель.
При анализе силосов из трав, выращенных на фоне высоких доз азотных
удобрений, денитрифицирующие бактерии учитывают на среде Гильтая (среда 7).
Посевы выдерживают 10–12 дней при 28 °С. Количество денитрификаторов определяют по интенсивности выделения газа и изменению цвета индикатора.
При анализе силоса учитывают также споры аэробных гнилостных бацилл.
На плотной среде (среда 8) делают поверхностный посев. Чашки инкубируют
при 28 °С, подсчет колоний выполняют на 4-е сутки.
51
Бактерии группы кишечной палочки учитывают на среде Кесслера (среда 9) или среде Булира (среда 10) по выделению газа и накоплению его в поплавках. Пробирки выдерживают 48 ч при 40–42 °С.
Доминирующие на плотных средах колонии микроскопируют. Для обнаружения маслянокислых бактерий из пробирок с картофелем готовят препарат
в раздавленной капле с добавлением раствора Люголя.
52
Лабораторная работа № 9
МИКРОБИОЛОГИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ПРОДУКТОВ
(ЗЕРНА, ПЛОДОВ, ОВОЩЕЙ)
На поверхности зерна обитает разнообразная микрофлора. Часть микроорганизмов попадает туда из ризосферы, часть заносится с пылью и насекомыми.
Однако на зерне, как и на всей поверхности растений, развиваются лишь некоторые микроорганизмы, так называемые эпифиты. Эпифитные микроорганизмы, размножающиеся на поверхности стеблей, листьев и семян растений,
получили название микроорганизмов филлосферы. Эпифиты питаются продуктами экзосмоса растений; устойчивы к высоким концентрациям фитонцидов,
выдерживают периодические колебания влажности.
Численность этих микроорганизмов невелика, и видовой состав их довольно постоянен: более 90% составляют гнилостные бактерии, в основном – неспороносные (род Pseudomonas). Особенно часто на зерне встречается Envinia
herbicola, образующая на плотных средах золотисто-желтые колонии. Встречаются также Pseudomonas fluorescens, микрококки, молочнокислые бактерии,
дрожжи. Бацилл и микроскопических грибов немного.
В определенных условиях эпифитные микроорганизмы могут быть полезны для растений, так как препятствуют проникновению паразитов в ткани растения. На хранении зерна присутствие эпифитных микроорганизмов может сказываться отрицательно.
На развитие микроорганизмов на зерне, а следовательно, на сохранность
последнего решающее влияние оказывают влажность, температура, степень
аэрации, целостность зерна и состояние его покровных тканей.
В зрелом зерне вода находится в связанном состоянии и недоступна микроорганизмам, которые в этом случае пребывают в состоянии анабиоза (покоя).
На зерне с повышенной влажностью микроорганизмы размножаются и тем
быстрее, чем выше температура. Развитие микробиологических процессов на
хранящемся зерне с повышенной влажностью приводит к заметному, а иногда
53
и очень значительному повышению его температуры. Это явление получило
название термогенез.
Самонагревание зерна ведет к смене микрофлоры. Свойственные зерну
эпифитные микроорганизмы исчезают. Начина ют обильно размножаться непигментированные неспороносные палочки, вытесняющие Erwinia herbicola.
Позднее появляются термостойкие (термотолерантные) микрококки, на плотных средах чаще всего образующие мелкие белые плоские колонии, а также
плесневые грибы, актиномицеты. Самонагревание свыше 40–50 °С способствует развитию спорообразующих и термофильных бактерий. По мере самонагревания изменяется видовой состав и плесневых грибов: виды Penicillium, преобладающие вначале, заменяются представителями рода Aspergillus.
Таким образом, по видовому составу микрофлоры можно судить не только
о том, подвергалось ли зерно самонагреванию, но и насколько далеко зашел
этот процесс. Преобладание Erwinia herbicola в микробном ценозе зерна служит
показателем его хорошего качества. Большое количество спорообразующих
бактерий и грибов указывает на потерю семенами всхожести.
Благоприятные условия для развития на поверхности зерна микроорганизмов кроме порчи самого зерна способствуют накоплению выделяемых микроорганизмами токсинов. При скармливании такого зерна скоту и домашней птице возникают отравления. Таким образом, правильное хранение зерна сводится
к тому, чтобы не допускать развития на нем микроорганизмов.
Материалы и оборудование: зерно в колбах – свежее и хранившееся
в условиях повышенной влажности, свежие и поврежденные плоды и овощи,
весы и разновесы, часовые стекла, колбы со стерильной водой (по 90 мл), колбы со стерильной водой (по 50 мл) и песком, стерильные пипетки Мора на 10
и 1 мл, стерильные чашки Петри, МПА в пробирках и колбах, водяная баня,
треножник, микроскопы и все необходимое для микроскопирования.
Ход работы
Количественный учет КОЕ на зерне
Навеску массой 5 г помещают в колбу с 50 мл стерильной водопроводной
воды и 2–3 г песка. Колбу взбалтывают круговыми вращательными движения-
54
ми 10 мин. Из полученной вытяжки готовят разведения. Отдельными стерильными пипетками Мора берут по 10 мл суспензии и переносят в колбы, содержащие 90 мл стерильной водопроводной воды. Затем из каждой колбы берут по 1 мл суспензии соответствующего разведения и вносят их в стерильные
чашки Петри в двух повторностях. В каждую чашку Петри выливают по одной
пробирке расплавленного, но предварительно охлажденного до 50 °С МПА.
Чашки инкубируют при 30 °С. Наряду с МПА используют элективные среды.
Через 3–5 суток инкубации подсчитывают общее число КОЕ на МПА в чашках
и рассчитывают количество КОЕ на 1 г зерна.
Определение качественного состава микроорганизмов зерна
Колонии группируют по культуральным признакам. Из каждой группы колоний готовят препараты, выявляют принадлежность микроорганизмов к роду или
виду и определяют численность бактерий каждой группы в процентах от общего числа микроорганизмов. На основании микробиологического анализа делают
заключение о качестве зерна.
На свежем доброкачественном зерне преобладает Erwinia herbicola (до
80 %), образующая блестящие оранжевые колонии. Встречается Pseudomonas
fluorescens, формирующая желтовато-зеленоватые флуоресцирующие колонии;
не-пигментированные неспорообразующие палочки; дрожжи – блестящие, выпуклые, часто окрашенные в розовые тона колонии. При учете на сусло-агаре
с мелом выявляются молочнокислые бактерии, образующие чечевицеобразные
мелкие колонии с зонами растворения мела.
На несвежем зерне, хранившемся при повышенной влажности, Erwinia
herbicola, Pseudomonas fluorescens не выявляются. Обнаруживаются микрококки, образующие мелкие белые блестящие плоские колонии; спорообразующие
палочки; актиномицеты, а также неспорообразующие палочки. При учете на
сусло-агаре выявляется значительное количество грибов, главным образом относящихся к роду Penicillium, а также Aspergillus.
55
Лабораторная работа № 10
ИЗУЧЕНИЕ ЭПИФИТНОЙ
И ПАТОГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ РАСТЕНИЙ
Болезнь растения – это сложный динамический процесс, в основе которого
лежит взаимодействие между растением-хозяином и патогенным организмом,
в результате чего происходит нарушение физиолого-биохимических процессов,
приводящее к снижению продуктивности растений.
Болезни растений классифицируют для правильного подхода к диагностике, т. е. установлению причин их возникновения.
В зависимости от этиологии (причины)
все болезни растений делятся на
две группы: инфекционные и неинфекционные.
Инфекционные болезни вызывают различные возбудители – грибы, бак-
терии, вирусы, вироиды, фитоплазмы (микоплазмы), нематоды, высшие цветковые растения и др. Общий признак этих болезней – способность их передаваться от одного растения к другому.
Неинфекционные болезни возникают в результате неблагоприятных для
растений условий выращивания – почвенных, климатических.
В зависимости от степени локализации болезни растений делят на местные
(локальные) и общие (диффузные).
Местные болезни поражают небольшие участки или отдельные органы, не
распространяясь по всему растению.
При
общих болезнях поражается все растение или большая его часть.
Неинфекционные болезни, как правило, относят к общим. Например, при
почвенной засухе увядает все растение. Инфекционные болезни, в зависимости
от характера распространения возбудителя, могут быть как общими, так
и местными.
По продолжительности развития болезни делят на острые и хронические.
Острые – развиваются быстро и заканчиваются в пределах одного периода ве-
гетации,
хронические – на многолетних растениях.
56
Болезни разделяют по способности поражать растения в определенной фазе развития: болезни всходов (сеянцев, рассады), питомников и взрослых растений. Существует классификация по поражаемым органам: болезни семян, плодов, клубней, корней, листьев, стволов и др. В зависимости от того, какие группы сельскохозяйственных культур ими поражаются, различают болезни хлебных злаков
, картофеля, овощных культур, плодовых культур и т. д. Выделяют
несколько основных типов болезней растений, вызываемых фитопатогенными
микроорганизмами.
Увядание – поражение корневой и проводящей систем растения-хозяина.
Возбудитель локализуется и развивается в проводящих сосудах, вызывает их
механическую закупорку, а также выделяет токсины и ферменты, угнетающие
растение: на листовой поверхности образуются некротические пятна, листья
буреют и опадают, растение увядает. Причиной увядания могут быть и абиотические факторы (недостаток влаги, высокая температура
Гнили – размягчение и разрушение тканей различных органов растений
и др.).
под воздействием метаболитов микроорганизмов.
Пятнистости, или некрозы, – характеризуются образованием на пора-
женных органах растений пятен разной формы, состоящих преимущественно из
отмерших клеток (могут иметь биотическое и абиотическое происхождение).
Опухоли, или наросты, – разрастание пораженной под влиянием возбуди-
теля болезни. Опухоли возникают в результате гипертрофии или гиперплазии
пораженных клеток.
Изъязвления, или антракнозы, – пятнистость различных органов расте-
ния, характеризующаяся размягчением ткани и образованием углублений, в которых развивается спороношение фитопатогена.
Налеты – появление на поверхности пораженных органов растений мице-
лия или спороношения патогена разного цвета.
Пустулы – скопление спороношения фитопатогена, выпуклые образова-
ния под эпидермисом или перидермой растения.
57
Мумификация – усыхание, затвердевание, и почернение пораженного
органа растения, густо пронизанного мицелием (склероциями) возбудителя заболевания.
Деформация – изменение формы отдельных органов или всего растения
в результате поражения фитопатогенами или воздействия абиотических факторов. Деформация проявляется в виде скручивания, морщинистости, курчавости
или нитевидности листьев, махровости цветков, уродливости плодов, повышенной ветвистости побегов (ведьмины метлы) и т. д.
Камедетечение – образование трещин на поверхности пораженных орга-
нов растений, из которых выделяется жидкость, темнеющая и затвердевающая
на воздухе.
Пылящая масса – разрушение пораженной ткани органов растений, ха-
рактеризующаяся образованием большого количества спор (головня).
Изменение окраски – возникает из-за нарушения деятельности хлоропла-
стов и низкого содержания хлорофиллов в листьях. Проявляется в виде пожелтения, осветления листьев (хлороз) или отдельных участков листьев (мозаика).
Причинами изменения окраски могут быть плохая обеспеченность питанием
(макро- и микроэлементами) или поражение патогенами.
Симптомы заболеваний могут быть как хорошо видимыми простым глазом, так и едва уловимыми, или скрытыми, которые проявляются при определенных условиях. Для того чтобы правильно бороться с заболеваниями, необходимо уметь их распознавать, т. е. по совокупности внешних признаков ставить правильный диагноз.
альный
Для установления диагноза болезни прежде всего применяется
метод. Производится наружный осмотр растений. Особое внимание
визу-
уделяется выявлению среди внешне здоровых растений, растений с определенными отклонениями в росте, развитии и т. д. На этом этапе исследования проводится визуальный сравнительный анализ здоровых и больных растений,
устанавливаются симптомы заболевания.
58
1
4
2 3
5 6
Рис. 10. Типы поражения растений:
1 – увядание; 2 – пятнистость; 3 – пустулы; 4 – мумификация;
5 – гниль; 6 – деформация
В практике диагностики болезней растений могут встречаться такие случаи, когда внешние признаки двух или нескольких заболеваний совпадают
между собой, а причины этих заболеваний различны.
Для точного определения болезни приходится прибегать к дополнительным методам диагностики. Чаще всего используется
59
микроскопический ме-
тод – изучение срезов тканей, спороношения грибов, экссудата бактерий, ви-
русных включений под микроскопом, что дает возможность обнаружить возбудителя или характер изменения в пораженных тканях.
Для более точного определения возбудителя используют культуральный
метод, В этом случае патогенный организм выделяется на искусственную пи-
тательную среду и содержится в термостате при определенной температуре
и влажности в течение установленного срока.
При диагностике методом влажной камеры пораженные органы для про-
явления спороношения при грибных заболеваниях или экссудата – при бактериальных помещают в условия благоприятные для развития патогена, создавая
повышенную влажность путем раскладки больных растений, их частей или семян на увлажненную фильтровальную бумагу в чашки Петри и поддерживая
оптимальную температуру (+24–26 °С). Закладку пораженных органов растений во влажные камеры часто проводят после их поверхностной стерилизации
(70–94 % этиловым спиртом, 0,1–2 % раствором хлорамина), чтобы исключить
развитие сапрофитных организмов случайно попавших на поверхность растения. После выявления патогена, его для дальнейшего изучения пересевают на
искусственные питательные среды.
Для определения особенностей течения болезни растения, степени специализации возбудителя применяют искусственное заражение здоровых растений
чистой культурой патогена.
Современная фитопатологическая диагностика располагает дополнительными методами исследования, обогащающими и расширяющими диагностические возможности серологическим, электронномикроскопическим, биохимическим и др.
Материалы и оборудование: свежие, гербарные и фиксированные образ-
цы органов растений, пораженных болезнями: сухой и мокрой бактериальной
гнилью картофеля, фитофторозом картофеля и томата, раком картофеля, килой
капусты, спорыньей ржи, мучнистой росой, ржавчиной злаков, фузариозным
увяданием льна, томата, картофеля, бактериозом и антракнозом листьев огурца,
60
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]