Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Микробиология. Учебно-методическое пособие для проведения лабораторных работ
.pdf
товка; фильтровальная бумага, кристаллизатор с подставкой для препаратов,
промывалка с водой, 1% раствор серной кислоты, 5% раствор хромовой кислоты, карболовый фуксин Циля, водный раствор метиленового синего по Лефферу, микроскоп
Ход работы.
1. На предметное стекло наносят мазок из культуры микроорганизма
2. Мазок высушивают, заливают 5 % раствором хромовой кислоты на
5 мин.
3. Мазок
промывают водой, покрывают листом фильтровальной бумаги.
4. Заливают раствором карболового фуксина, окрашивают 6–8 мин при
нагревании до образования паров, добавляя краситель.
5. Мазок тщательно промывают водой.
6. Наносят каплю 1 % раствора серной кислоты на 30–60 сек.
7. Мазок промывают водой и докрашивают раствором метиленового сине-
го по Леффлеру в течении 10 мин.
8. Мазок окончательно промывают водой
и высушивают на воздухе
В результате споры окрашиваются в красный, а цитоплазма – в синий,
цвет.
Окраска капсул.
Многие виды бактерий на определенной стадии развития формируют капсулы. Капсула представлена слизистым слоем, состоящим из полисахаридов
и полипептидов. Капсулы выполняют защитную функцию. Для окраски капсул
применяют негативное окрашивание, в результате которого межклеточное
пространство окрашивается тушью или каким-либо красителем, а клетки остаются
неокрашенными. На темном фоне хорошо заметна бесцветная капсула окружающая клетку.
Оборудование и материалы: культура бактерий, образующих капсулы.
Предметные стекла, микробиологическая петля, спиртовка, кристаллизатор
с подставкой для препаратов, промывалка с водой, фильтровальная бумага,
21
микроскоп, черная тушь, карболовый фуксин Пиля, дистиллированная вода,
смесь Никифорова (смесь этанола и эфира в соотношении 1:1).
Ход работы.
1. На конец предметного стекла петлей наносят каплю черной туши и в нее
вносят исследуемый материал.
2. Жидкость перемешивают и ребром предметного стекла делают мазок по
всей поверхности препарата.
3. Мазок высушивают на воздухе
и фиксируют смесью Никифорова в те-
чении 5–10 мин.
4. Мазок окрашивают карболовым фуксином Циля, разбавленным водой
в соотношении 1 : 3 в течении 3–5 мин.
5. Промывают водой, высушивают на воздухе.
Окраска жгутиков
Жгутики – это тончайшие нитевидные выросты цитоплазматической природы, которые служат для перемещения бактериальных клеток. Число и расположение жгутиков бактерий является важными диагностическими признаками,
но они очень тонкие (диаметр не превышает 0,04 мкм). Поэтому способы
окраски жгутиков основаны на протравливании мазка танином. В результате
такой обработки они значительно увеличиваются в
диаметре и после окраски
становятся видимыми в световой микроскоп.
Оборудование и материалы: обезжиренные предметные стекла, пробирка
со стерильной водой, стерильные пипетки на 1 мл, микробиологическая петля,
спиртовка, пинцет, микроскоп. Раствор А – 10% водный раствор танина – 20 мл
+ 6 % водный раствор хлорида железа – 7 мл. Раствор Б – раствор А – 4 мл +
1 % водный раствор кристаллического фиолетового – 0,5 мл +
концентрированная соляная кислота – 0,5 мл + 40% раствор формалина – 2 мл. Чистые культуры микроорганизмов, 1% водный раствор кристаллического фиолетового. Растворы А и Б необходимо фильтровать.
22
Ход работы.
Окраска жгутиков по методу Шимвелла.
1. Из культуры микроорганизмов готовят суспензию.
2. Микробиологической петлей осторожно (не размазывая) переносят кап-
лю суспензии на предметное стекло.
3. Препарат высушивают на воздухе, фиксируют парами 2 % раствора ос-
миевой кислоты или парами 40 % формалина 3–5 мин.
4. Фиксированный препарат обрабатывают раствором А в течении 15 мин.
5. Раствор сливают
, препарат промывают раствором Б в течении 7–10 мин.
6. Раствор сливают, промывают препарат водой.
7. Препарат ополаскивают 1 % водным раствором кристаллического фио-
летового и окрашивают этим же красителем при нагревании 3–5 мин
8. Промывают водой, просушивают на воздухе. Микроскопируют.
23
Лабораторная работа № 4
ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОФЛОРЫ ВОЗДУХА
Материалы и оборудование: чашки Петри с посевами предыдущего заня-
тия, пробы исследуемой воды, МПА, микроскоп, предметные стекла, спиртовки, препаровальные иглы, стерильные, мккропипетки на 1 и 10 мл, стерильные
чайки Петри, таблетки антибиотиков, лук, чеснок.
Микробы почвы, воды и воздуха весьма разнообразны. Количество микро-
организмов разных
видов зависит от условий: света, влажности, температуры,
характера питательной среды, её рН и других факторов,
Воздух – наименее благоприятная среда для жизни микробов. Микробы
и их споры попадают в воздух из почвы или воды. Хорошая освещенность воздуха солнечными лучами, отсутствие питательных веществ и влаги – все эти
условия не способствуют жизни
микробов в воздухе.
Изучение количественного и качественного состава микроорганизмов воздуха имеет большое значение для санитарной оценки классов, кабинетов и мает
общественного пользования в школе, комнате, общежитии, столовой.
Известны две группы методов количественного учета микробов.
1. Методы, основанные на непосредственном подсчета микробов под мик-
роскопом.
2. Методы, связанные с выращиванием микроорганизмов
на питательных
средах с последующим подсчетом количества колонии, разросшихся бактериальных клеток или спор. При непосредственном подсчете микроорганизмов под
микроскопом учитываются и живые, и мертвые клетки. Метод посева дает возможность учесть только число живых клеток.
Ход работы:
Подготовленную питательную среду разливают и стерильные чашки Пет-
ри. Для этого поднимают
, с одной стороны, крышку и в щель быстро выливают
горячий раствор МПА, наполняя на 1/3 высоты чашки. Слегка покачивая чаш-
24
ку, распределяют среду равномерно по её дну и оставляет стоять на ровной
поверхности.
Когда агар-агар полностью остынет и затвердеет, производят посев микроорганизмов и спор из воздуха. Для этого приготовленные чашки Петри (2–3)
размещают в разных местах исследуемых помещений и на 5 мин закрывают
крышки. При этом микроорганизмы и споры, содержащиеся в
воздухе, постепенно осаждаются на открытой поверхности aгap-aгаpа. Через 5 мин. чашки закрывают, и на боковой поверхности крышки восковым карандашом отмечают,
кто и где производил посев. Чашки Петри завёртывают в бумагу и помещают
в термостат на 7 дней при температуре 23–26 °С. В термостате чашки Петри
держат крышками вниз, чтобы
конденсирующая влага не смачивала посева.
Можно поставить также следующий опыт: произвести посей в одних и тех
же условиях в три чашки Петри. Одну из них оставить для контроля, в другую
влить 1 мл раствора пенициллина или другого антибиотика, а в третью положить немного растертого лука или чеснока (фитонциды).
Подсчет количества колоний
в чашках Петри при прямом посеве из воздуха. Рассматривают в чашках Петри колонии. Ориентировочно определяют,
к какой группе микроорганизмов относится та или иная из них, oписывают
наиболее интересные группы колоний форму, цвет, очертания края, поверхность и т. д.
Подсчитывают число колоний в чашках Петри и рассчитывают количество
микробов
подсчетам (Омелянский) на площади в 100 см
в 10 л воздуха. При этом учитывает следующее: по приблизительным
2
в течении 5 мин. оседает столь-
ко микроорганизмов и спор, сколько их содержится в 10 л воздуха.
Допускаем, что каждая колония возникла из одной клетки или споры.
Пример расчета: в чашках Петри обнаружено в средним по 15 колоний, радиус чашки Петри 5 см, площадь ее равна 3,14 *25 см
2
= 78,5 см2.
Тогда в 10 л воздуха содержится:
А = (15*100)/ 78, 5 = 19 микроорганизмов или спор.
25
Произведя расчеты, выясняют различия в количественном составе микро-
флоры тех помещений, где производился посев из воздуха. Устанавливают влияние антибиотиков и фитонцидов на микроорганизмы.
Делают вывод о том, как влияют на рост колоний указанные факторы.
Микроскопическое исследование микроорганизмов из наиболее интерес-
ных колоний, выросших в чайках Петри. Приготавливают фиксированные
и окрашенные
препараты, рассматривает их с иммерсионным объективом.
Определяют, к какой группе относятся обнаруженные микроорганизмы (кокки,
палочки, сарцины, дрожжи, грибы). Сделать рисунки.
26
Лабораторная работа № 5
ИЗУЧЕНИЕ МИКРОФЛОРЫ ВОДЫ
Материалы и оборудование: чашки Петри с посевами предыдущего заня-
тия, пробы почвы, МПА, микроскопы, предметные стекла, спиртовки, препаровальные иглы, стерильные чашки Петри, колба, микропипетки на I мл.
Вода – естественная и весьма благоприятная среда для жизни микро-
организмов. Главная масса микробов, населяющих воду, рек, озер
и даже морей, попадает в них непосредственно из почвы или через воздух (с пылью). Поэтому состав микробов воды зависит от её загрязнения и носит в значительной
степени случайный характер. Особенно сильно загрязнены водоемы, расположенные вблизи населенных пунктов.
Ход работы: Берут пробы воды из водопровода или из открытого
водоема.
1 мл исследуемой воды переносят в колбу № 1, где находится 99 мл стерильной
воды – получают первое разбавление до 0,01. Содержимое колбы встряхивают,
стерильной пипеткой отбирают 1 мл жидкости к переливают в пробирку № 1
(9 мл стерильной воды) – получают разбавление 0,001. Отбирают из колбы №1
еще 1 мл раствора и приливают его в колбу №1 (99 мл
стерильной воды) – получают разбавление 0,0001. Из колбы № 2 отбирают 1 мл в пробирку № 2 – получают разбавление 0,00001. Из колбы № 2 отбирают 1 мл раствора и приливают в колбу № 3 – получают последнее разбавление 0,000001. При разбавлении
суспензии каждый раз пользуются стерильной пипеткой.
После тщательного взбалтывания содержимого всех сосудов берут из каж-
дого 0,1–1 мл
жидкости и выливают в отдельные чашки Петри на еще теплый
питательный стерильный агар-агар. На боковой чашке Петри или на бумаге,
в которую она завернута, отмечают степень разбавления. Все чашки оставляют
на недолю в термостате вначале (2 дня) при температуре 30 °С, а затем при
20–23 °С.
Посла подсчета числа колоний микробов в
чашках Петри с определенным
разбавлением рассчитывают их количество на 1 мл исследуемой воды.
27
Пример расчета: в чашке Петри 1 % с разбавлением 1:1000000 выросло
6 колоний. На одной микробной клетке или споры вырастает одна колония. Тогда количество микробов в 1 г почвы или в 1 мл воды будет равно:
A
6
0,000001 1 мл
6
610 (микробов).
Описание колоний микробов, выросших на питательной среде, проводят
по следующим показателям; форма (округлая, неправильная), поверхность
(гладкая, блестящая, шероховатая, сухая, складчатая), край (ровный, волнистый, городчатый), цвет, размер.
Затем исследуются микроорганизмы из наиболее интересных колоний. Для
этого готовят фиксированные и окрашенные препараты и рассматривают их
с иммерсионным объективом. Делают зарисовки микробов.
В конце занятия проводится посев микрофлоры почвы по методике, изложенной в работе 4.
28
Лабораторная работа № 6
ИЗУЧЕНИЕ МИКРОФЛОРЫ ПОЧВ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ
Материалы и оборудование: чашки Петри с посевами, микроскопы,
предметные стекла, спиртовки, препаровальные иглы.
Почва является наиболее благоприятной средой для жизни микробов. Она
богата различными питательными веществами, влагой. В почве микробы защищены от действия прямых солнечных лучей. Большинство микроорганизмов – бактерий, грибов, водорослей и простейших – живет в верхних слоях
почвы, где количество их в 1 г исчисляется сотнями миллионов. Микроорганизмы принимают участие в
минерализации веществ, находящихся в поч-
ве, и способствуют повышению её плодородия.
Ход работы: готовят суспензию исследуемой почвы, для чего отвешивают
1 г почвы и тщательно размешивают её в 100 мл воды. Дают взвеси в течение
10 мин отстояться, а затем пипеткой отбирают для разведения в стерильной во-
де 1 : 1000, 1 : 100000 и т. д.
полученных разведении производят посев по 1мл в расплавленный
Из
МПА в чашках. Ввиду огромной численности микробов в почве посев рекомендуется производить из больших разведений, не ниже чем 1 : 1000. Засеянные чашки помещают в термостат на 5–7 дней при температуре 25–30 °С после
чего считают количество выросших колоний, и делают пересчет на 1 г почвы.
Примеры расчета и описание колоний приводились в
работе 3.
Исследуются микроорганизмы из наиболее интересных колоний, делаются
зарисовки микробов.
29
Лабораторная работа № 7
ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ
МИКРООРГАНИЗМОВ И РАСТЕНИЙ
С семенами могут передаваться многие возбудители болезней зерновых
культур, зерновых и кормовых бобовых, льна, свеклы, подсолнечника и других
культур. Зараженные семена имеют пониженные энергию прорастания и всхожесть, являются причиной развития ослабленных, низкопродуктивных растений. Часто растения из зараженных семян не развиваются вовсе
. Кроме того,
больные семена нередко бывают источниками первичной инфекции, от которых заражаются соседние здоровые растения.
Методы определения зараженности семян грибами и бактериями
Существуют различные методы фитопатологической экспертизы. Наибо-
лее распространены следующие методы.
МЕТОД НАРУЖНОГО ОСМОТРА (ВИЗУАЛЬНЫЙ)
Этим методом определяют внешние изменения посевного материала
(наличие семян щуплых, тусклых, с розовым
оттенком, с почерневшим заро-
дышем, покрытых плесенями) или устанавливают наличие примесей (склероциев спорыньи, белой гнили, головневых мешочков и комочков).
С помощью лупы можно обнаружить скопление спор в бороздках семян,
хохолках, пикниды возбудителей аскохитоза, септориоза, фомоза.
Семена низкого качества могут выявляться не только по внешнему виду,
но и по запаху (
затхлый при плесневении и т. п.).
МЕТОД ОБМЫВКИ СЕМЯН И ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ
Применяют для выявления спор головни на поверхности семян зерновых
культур и лука; пасмо на семенах льна; рамуляриоза на семенах кориандра;
ржавчины на клубочках свеклы и семенах аниса; гельминтоспориоза, фузариоза, головни на семенах риса.
Ход работы. Из семян культуры
дой. Каждую пробу помещают в пробирку, заливают водой (10 см
отсчитывают две пробы по 100 семян в каж-
3
) и взбал-
30
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]