Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Микробиология. Учебно-методическое пособие для проведения лабораторных работ
.pdf
тывают. Семена с гладкой поверхностью (пшеница, рожь) взбалтывают в течение
5 мин., с шероховатой поверхностью (свекла и др.) – 10 мин, семена льна – 1 мин.
Для выделения спор применяют центрифугирование. Для этого суспензии
сливают в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 10–15 мин
при частоте вращения 2000–2500 мин. После центрифугирования из пробирок
осторожно отбирают 9 см
3
надосадочной жидкости. Оставшийся осадок пере-
мешивают пипеткой и из осадка каждой пробирки готовят 5 препаратов. Для
определения вида гриба препараты просматривают под микроскопом.
Количественный учет спор проводят в камере Горяева.
Зараженность спорами одного семени (Х – число спор) вычисляют по фор-
мулам:
при подсчете в камере Горяева без предварительного центрифугирования:
X
1
,
100
Nc
10
при подсчете в камере Горяева с предварительным центрифугированием
Nc
X
1
где 10 – объем воды, взятой для смыва, см
,
100
3
; Nc – число спор в 1 см3 суспензии;
100 – число семян, взятых для анализа.
Число спор в 1 см
3
суспензии (Nc) рассчитывают, умножая обнаруженное
число спор на 250 тыс., если подсчет спор ведут в больших квадратах камеры
Горяева, и на 400 тыс., если споры подсчитывают в малых квадратах камеры.
Если подсчет проводят по всей площади камеры, то обнаруженное число
умножают на 1111. Искомое число определяют как среднее арифметическое результатов двух проб.
МЕТОД
ОТПЕЧАТКОВ
Метод применяют вместо центрифугирования для определения степени заражения семян зерновых культур спорами головневых грибов.
Ход работы. Отбор проб. Отсчитывают 10 семян культуры. Каждое семя
обертывают прозрачной клейкой лентой площадью 1 см
2
, плотно прижимая ее
31
по всей поверхности семени. После этого с помощью пинцета ленту отклеива-
S
ют и помещают на предметное стекло под микроскопом для идентификации патогена и подсчета спор. Подсчет проводят в 10 полях микроскопа и устанавливают среднее арифметическое число спор в одном поле зрения микроскопа при
42-кратном увеличении.
Для пшеницы и ячменя
с помощью окуляр-микрометра под микроскопом
при 42-кратном увеличении измеряют длину и ширину семени с точностью до
0,1 мм, затем определяют площадь поверхности семени.
Площади поверхности семян других зерновых культур измеряют наложением их отпечатков на миллиметровую бумагу или посредством окулярной сетки микроскопа.
Обработка результатов. Число спор, приходящееся на площадь
семени (Х
), вычисляют по формуле
3
X
3
NS
1
;
где N – среднее арифметическое число спор в поле зрения микроскопа; S
щадь поверхности семени, мм
2
; S – площадь поля зрения микроскопа, мм2.
отпечатка
– пло-
1
Пример. Площадь поверхности семян пшеницы при длине 6 мм и ширине
3,5 мм равна 57,7 мм
2
. Если в одном поле зрения микроскопа МБС-9 при
42-кратном увеличении насчитывается в среднем 10 спор, то число их на одном
семени составляет Х
= (10 х 57,7): 3,2 =180.
3
Примечание. По паспортным данным площадь поля зрения микроскопа
МБС-9 при 42-кратном увеличении равна 3,2 мм
2
Среднее арифметическое число спор, приходящееся на одно семя (Y), вы-
числяют по формуле
X
Y
3
10
где
X – сумма чисел спор, обнаруженных на всех исследованных семенах;
3
10 число исследованных семян.
32
МЕТОД ВЛАЖНЫХ КАМЕР
Ход работы. Из семян культуры отбирают 4 рабочие пробы по 50 или 100
семян в зависимости от вида анализируемых культур. В качестве влажной камеры используют чашки Петри, Коха или стеклянные стаканы, накрытые стеклом. На дно чашек (стаканов) помещают марлю в 3 слоя, фильтровальную бумагу в 2 слоя или фильтровальную бумагу, положенную на гигроскопическую
вату (
толщина слоя не более 0,25 см).
Перед раскладкой семян чашки стерилизуют и заворачивают в бумагу.
Марлю, комбинированный субстрат или фильтровальную бумагу увлажняют
кипяченой или стерилизованной водой комнатной температуры. Семена раскладывают в боксе стерильным пинцетом на расстоянии 1...2 см одно от другого в зависимости от их размеров.
Закрытые чашки Петри, Коха или
стаканы с заложенными в них семенами
помещают в термостат для проращивания.
Термостаты предварительно тщательно моют горячей водой с моющими
средствами и дезинфицируют 1%-ным раствором перманганата калия через
каждые 10 дней. Перед каждым фитопатологическом анализом их дезинфицируют спиртом или бактерицидными лампами в течение 30 мин. Раз в месяц
термостаты дезинфицируют с помощью
бактерицидных ламп в течение 8 ч.
Проведение анализа. Просмотр семян пшеницы, ржи, ячменя, кукурузы,
льна, сои, эфиромасличных культур, подсолнечника, гороха проводят в сроки,
установленные для определения всхожести по ГОСТ 12044-93. Виды болезней
семян, выявляемые при проращивании во влажной камере:
Культура Болезни
Пшеница, ячмень Фузариоз, гельминтоспориозы, альтернари-
оз, септориоз, плесени
Рожь Фузариоз, гельминтоспориоз, септориоз
Овес Фузариоз, красно-бурая пятнистость
Кукуруза Фузариоз, диплодиоз, серая гниль
Соя Фузариоз, бактериоз, белая гниль, аскохи-
тоз, церкоспориоз, пероноспориоз
33
Для стимуляции образования конидиеносцев и конидий с целью идентификации возбудителей болезней необходимо 12-часовое чередование света при
освещенности 750–1250 лк и темноты.
АНАЛИЗ СЕМЯН НА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ
Ход работы. Из навески семян отбирают четыре пробы по 50 семян в каж-
дой и помещают их в стерильную посуду с питательной средой. Приготовление
картофельного агара: 200 г вымытого, очищенного, порезанного ломтиками
картофеля заливают 1000 см
3
воды и кипятят в течение 40 мин. После этого
раствор фильтруют, к фильтрату добавляют 20 г агара и подогревают до полного растворения агара. После этого раствор фильтруют через несколько слоев
марли с ватной прокладкой и стерилизуют под давлением 0,09807 МПА (1 атм)
в течение 30 мин. После стерилизации в питательную среду добавляют стерильный 50 %ля) на 10 см
1000 см
3
среды). Жидкость разливают по чашкам.
й раствор лимонной кислоты из расчета 0,1–0,05 см3 (одна кап-
3
или концентрированную молочную кислоту (4 см3 кислоты на
Семена промывают струей воды под водопроводным краном в течение
1–2 ч и дезинфицируют 1 %-м раствором перманганата калия, или 0,1 %-м рас-
твором нитрата серебра, или 96 %-м спиртом в течение 1–2 мин. После этого
семена промывают в стерильной или прокипяченной воде и подсушивают между листами стерильной фильтровальной бумаги
В стерильные чашки Петри диаметром 9,5...10 см наливают 10 см
.
3
просте-
рилизованного агара. Толщина слоя среды должна быть 3...4 мм, разливку питательных сред в чашки и закладку семян проводят в бактериологической камере (стерильном боксе). Раскладку семян проводят на застывшую питательную среду с помощью пинцета, периодически стерилизуя его на спиртовке.
АНАЛИЗ СЕМЯН В РУЛОНАХ ФИЛЬТРОВАЛЬНОЙ БУМАГИ
Используют 2 слоя увлажненной
до полной влагоемкости фильтровальной
бумаги. Размер полосок фильтровальной бумаги для пробы по 100 семян должен быть 10x110 см, для пробы по 50 семян – 10x55 см.
34
Ход работы. Семена раскладывают в одну линию с промежутком 1–2 см
на расстоянии 2–3 см от верхнего и боковых краев бумаги зародышами вниз.
Разложенные семена накрывают такой же полоской увлажненной фильтровальной бумаги, на которую, в свою очередь, накладывают полоску полиэтиленовой
пленки, и сворачивают в рулон. Рулоны ставят в сосуды в вертикальном положении
и помещают в термостат при температуре 22–25 °С.
При проращивании семян рулоны следует постоянно увлажнять.
Обработка данных. По каждой из четырех проб подсчитывают число се-
мян, зараженных каждой болезнью, и общее число зараженных семян.
Зараженность семян (в процентах) вычисляют по формуле
100
N
1
,
n
где N
X
– суммарное число зараженных семян в четырех пробах; n – общее число
1
семян, взятых для анализа.
СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД
Используется для обнаружения вирусных болезней в картофелеводстве
и для оздоровления семян. Основан на реакции между белками возбудителя
(антигенами) и антителами специфичной к ним сыворотки, полученной от иммунизации животных данным возбудителем.
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗАРАЖЕННОСТИ
СЕМЯН ВИРУСАМИ
Более 100 вирусов, поражающих различные культуры, передаются с семе-
нами. Различают два вида зараженности семян: поверхностный и внутренний.
В передаче вирусов семенами участвуют оба вида зараженности. Внутренняя
инфекция присутствует в семенах часто в очень низкой концентрации. Для ее
обнаружения требуются высокочувствительные методы диагностики. Зараженность семян вирусами диагностируют теми
же методами, которые используют
при определении вирусов в вегетирующих растениях: капельная серодиагностика, инокуляция индикаторных растений, иммуноферментный анализ, электронная микроскопия, ПЦР.
35
Для анализа семян используют их гомогенат в воде или буферном растворе, получаемый в гомогенизаторе или в фарфоровой ступке. Гомогенат фильтруют или центрифугируют, затем используют для серологической диагностики. Для индикаторной диагностики в гомогенат добавляют стабилизаторы
вирусов, например диэтилдитиокарбамат натрия (ДИЭКА). Стабилизаторы вирусов предотвращают инактивацию вирусов ингибиторами, содержащимися
в
семенах.
ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ
Задание 1. По образцам семян пшеницы, ржи, кукурузы, гороха, фасоли,
льна, капусты, подсолнечника (по одному образцу на каждый стол, за которым
работают студенты) провести их фитосанитарную оценку методом наружного
осмотра. Дать заключение о качестве семян.
Задание 2. Методом центрифугирования определить состав возбудителей
болезней на семенах пшеницы. При обнаружении спор головневых грибов
определить степень
засоренности зерновок.
Задание 3. Провести фитопатологический анализ семян с использованием
метода влажных камер. Для этого семена, предварительно продезинфицированные в 0,5 %-м растворе перманганата калия, посеять на увлажненную трехслойную фильтровальную бумагу в чашки Петри и установить в термостат
с температурой 18–20 °С. Через неделю провести анализ семян на грибную
и бактериальную инфекцию.
Определить род возбудителей заболеваний и процент поражения ими семян. Для этого пользуются рисунками (спороношение возбудителей).
36
11 13
Рис. 1. Телиоспоры головневых грибов
1 – Tillelia caries; 2 – T. foetida; 3 – Т. controversa; 4 – Т. indica; 5 – Urocystis
tritici, 6 – Ustilago tritici; 7 – Urocistis occulta; 8 – Ustilago hordei; 9 – U. nuda;
10 – U. teae; 11 – U. avenae; 12 – U. levis; 13 – Sphacelotheca panici-miliacei
37
Рис. 2. Спороношение грибов рода Drechslera
I – D. sorokiniana; 2 – D.graminea; 3 – D. teres
Рис. 3. Споры грибов рода Fusarium
1 – F. graminearum; 2 – F. avenaceum; 3 – F. culmorum; 4 – F. moniliformi
38
Рис. 4. Возбудители болезней на семенах бобовых культур
1 – Ascochita pisi (пикниды и споры); 2 – Colletotrichum lindemuthianum
(ложе гриба с конидиеносцами, конидиями и щетинками); 3 – Aureobasidium
pullulans (ложе со спороношением гриба); 4 – Botritis сinerea (конидиеносцы
и конидии); 5 – Fusarium solani (макро- и микроконидии)
Рис. 5. Возбудители болезней на соплодиях и семенах свеклы
a – Phoma betae (пикнида со спорами); б – Uromyces betae (1 – урединиоспоры;
2 – телиоспоры); в – Cercospora belicola (конидиеносцы с конидиями);
г – Peronospora schachlii (конидиеносец и конидии); д – Erysiphe communis
(3 – конидиеносцы с конидиями; 4 – клейстотеций; 5 – сумки с сумкоспорами)
39
Рис. 6. Возбудители болезни на семенах овощных культур
1 – Colletotrichum lagenarium на семенах растений семейства Тыквенные
(видны шерстинки, конидиеносцы и конидии); 2 – Alternaria brassicae
(конидии гриба); 3 – A. oleraceae (конидии); 4 – A. radicna (конидии)
Рис. 7. Возбудители болезней на семенах подсолнечника
а – Verticillium dahliae (конидиеносец и конидии);
б – Wetzelinia sclerotiorum (1, 2 – прорастающие склероции; 3 – сумки
с сумкоспорами); в – Botrilis cinerea (4 – конидиеносец; 5 – конидии)
40
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]