Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Микробиология. Учебно-методическое пособие для проведения лабораторных работ
.pdf
Лабораторная работа № 2
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Цель: ознакомить студентов с классификацией и принципами составления
питательных сред, научиться правильно готовить жидкие и твердые питательные среды для различных групп микроорганизмов
Для выделения микроорганизмов из исследуемого материала, сохранения и
поддержания роста используют питательные среды. Среды для культивирования микроорганизмов должны являться источником питательных
веществ
и обеспечивать физические и химические условия для их жизнедеятельности.
Существует несколько принципов классификации микробиологических
питательных сред. По составу они могут быть естественными, полусинтетическими и синтетическими. В зависимости от цели исследования применяют
элективные и дифференциально-диагностические, консервирующие питательные среды. По консистенции их разделяют на жидкие и плотные (твердые).
Естественные
питательные среды состоят из продуктов растительного или животного происхождения, используемых в виде отваров или вытяжек (молоко,
мясной бульон, дрожжевой экстракт, пивное сусло и т. д.).
Состав синтетических сред всегда известен. Содержание в них всех ком-
понентов строго определенно (соли металлов, сахара, витамины и т. д.).
Полусинтетические питательные среды содержат
как биологические, так
и химические соединения.
На элективных питательных средах развиваются только определенные
микроорганизмы, развитие других замедленно или подавлено. Эти среды используют для выделения микроорганизмов из их естественной среды обитания
(элективная среда для энтеробактерий).
Дифференциально-диагностические среды служат для быстрого разделения отдельных видов микроорганизмов. Состав этих сред подбирается
таким
образом, чтобы в процессе культивирования четко проявился характерный признак данного вида. Часто это достигается добавлением к среде определенного
11
красителя и колонии микроорганизмов окрашиваются в соответствующий цвет
(в среде Козера для диагностики энтеробактерий используется 1,5 % раствор
бромтимолового синего).
Для получения твердых сред к жидким питательным растворам добавляют
агар-агар (полисахарид сложного состава из морских водорослей) в количестве
15–20 г/л или желатину.
При приготовлении питательных сред следует обращать внимание на чис
-
тоту посуды (колб, пробирок...), чистоту и дозировку 'используемых химических веществ. Компоненты питательной среды растворяют поочередно в том
порядке, как они приведены в рецепте. Агар-агар расплавляют на водяной или
паровой бане. Проверяют рН среды и доводят 0,1 Н раствором гидроксида
натрия (NaOH) или соляной кислоты (НС1) до необходимого значения.
Стерилизация сред
производится в автоклаве при строго определенном
давлении и длительности обработки.
Приготовление мясо-пептонного бульона (МПБ жидкая среда)
К 1 л водопроводной воды добавляют 500 г говяжьего обезжиренного мяса, пропущенного через мясорубку, и оставляют настаиваться на холоду в течении суток. Процеживают через марлю, выдерживают настой на водяной бане
0,5 часа. Фильтруют. К бульону добавляют 5 г поваренной соли и 10 г пептона.
Затем осаждают растворимые белки, для этого бульон выдерживают в
автоклаве при 1 атм. в течении 20 мин. Фильтруют. Доводят кислотность среды до
нейтральной (рН – 7,0). Готовый бульон должен быть абсолютно прозрачным,
янтарно-желтого цвета.
Приготовление мясо-пептонного агара (МПА – твердая среда)
Плавится только при температуре около + 100 °С, а затвердевает при +44 °С,
и позволяет работать практически в любых температурных условиях.
Исходной средой для приготовления МПА является МПБ. К готовому бульону добавляют 2 % агар-агар и нагревают в автоклаве с открытым вентилем
до полного растворения агара. Среду с агаром фильтруют через марлю. Про-
12
фильтрованный МПА стерилизуют при 1 атм. в течении 20 мин. В колбе с ватной пробкой, накрытой бумажным колпачком.
Приготовление мясо-пептонной желатины (МПЖ – твердая среда)
Плавится при температуре +25 °С. Использование этой среды необходимо
при работе с определением вида бактерий, так как разжижение или не разжижение желатины микроорганизмами является одним из диагностических
признаков при определении их видовой принадлежности. В мясопептонный бульон добавляют 12–25 % мелконарезанной желатины. Растворяют желатину
при температуре не выше +100 °С. Затем среду фильтруют и
разливают в колбы
и пробирки. Стерилизуют МПЖ методом тиндализации.
Методы стерилизации и дезинфеции питательных сред и посуды
Стерилизация – уничтожение микроорганизмов и их спор в различных
объектах с помощью физических и химических факторов.
Дезинфекция – обеззараживание, уничтожение возбудителей инфекционных болезней (бактерий, грибов, вирусов и т. д.) во внешней среде путем применения физических и химических средств.
Стерилизация обжиганием над пламенем горелки
Небольшие предметы (петля, пинцет, скальпель) проводят несколько раз
через пламя горелки. Стерилизация достигается сгоранием и обугливанием
находящихся на их поверхности микроорганизмов.
Стерилизация кипячением
Стерилизацию металлических инструментов и резиновых трубок проводят
кипячением. Споры бактерий погибают при кипячении в 2 % растворе карбоната натрия в течении 10 мин.
Стерилизация сухим жаром
Сухим жаром стерилизуют стеклянную посуду. При этом пробирки, колбы
предварительно закрывают
ватными пробками. Пипетки с концов закрывают ватой, затем их обертывают длинными полосками бумаги. Чашки Петри заворачивают в бумагу. Подготовленную посуду помещают в сушильный шкаф, где нагревают ее до +160–170 °С в течении 2 часов (с момента установления температуры).
13
Стерилизация текучим паром. Дробная стерилизация или тиндализация
Питательные среды, воду, резиновые трубки и другие предметы, портящиеся под действием высокой температуры, стерилизуют действием текучего пара. Стерилизацию текучим паром проводят в кипятильнике Коха или в автоклаве с открытым вентилем. Для уничтожения спор бактерий стерилизацию поводят 3 раза. Питательную среду нагревают
паром до +100 °С. Такой режим нагревания в течении 30–45 мин. Приводит к гибели вегетативных клеток бактерий
Последующее снижение температуры до +25–30 °С способствует прорастанию
спор, которые уничтожаются повторным нагреванием питательной среды до
+100 °С
на следующий день. Для достижения полной стерильности питательные
среды оставляют еще на сутки при +25–30 °С и вновь повторяют нагревание.
Стерилизация паром под давлением (автоклавирование)
Стерилизуемые объекты нагревают в автоклаве чистым насыщенным паром при давлении выше атмосферного. Полная стерилизация питательных сред
достигается при +120 °С и давлении 1 атм. в течении 40 мин.
Пастеризация
В основе пастеризации лежит нагревание жидкостей до температуры
меньше +100 °С.
Целью ее является уничтожение неспороносных бактерий
в жидкостях, теряющих питательные свойства при кипячении.
Осуществляется пастеризация путем нагревания жидкостей при +60 °С
30 мин.; при +75 °С
– 15 мин.; при +80 °С – 10 мин.
Колония бактериальная – изолированное скопление клеток бактерий одного вида, сформированное на поверхности или внутри плотных или полужидких
питательных сред в результате размножения одной или нескольких бактериальных клеток. Внешний вид и строение колоний часто имеют свои особенности
и могут служить ориентировочным признаком для их идентификации. Колонии
бывают плоские, выпуклые,
куполообразные, вдавленные; поверхность их гладкая (S-формы), шероховатая (R-формы), бугристая; края могут быть ровные, зазубренные, волокнистые, бахромчатые. Форма колоний также разнообразна,
круглая, розеткообразная, звездчатая, древовидная. По величине колонии под-
14
разделяют на крупные (4–5 мм в диаметре), средние (2–4 мм), мелкие (1–2 мм).
Колонии отличаются по консистенции, плотности, цвету. Они бывают прозрачные и непрозрачные, окрашенные и бесцветные, влажные, сухие и слизистые.
КУЛЬТУРА БАКТЕРИАЛЬНАЯ – популяция жизнеспособных бактерий,
выращенная на плотной или жидкой питательной среде.
ШТАММ – культура микроорганизмов одного вида с одинаковыми мор-
фологическими и
биологическими свойствами.
15
Лабораторная работа № 3
МОРФОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ
Цель: изучить различные формы бактерий, морфологически отличаю-
щиеся друг от друга. Освоить способы приготовления прижизненных и фиксированных препаратов, простые и сложные методы окраски микроорганизмов.
Бактерии – самая распространенная и многочисленная группа микроорганизмов, морфологически отличающихся друг от друга по величине, расположению и форме отдельных клеток. По
форме бактерии делят на три группы: ша-
ровидные, палочковидные и извитые.
Шаровидные бактерии – кокки (Coccus). Моно-, или микрококки ( род Mi-
crococcus ). Клетки делятся в одной плоскости и после деления расходятся. Могут быть слегка вытянуты или несколько вогнуты с одной из сторон. Диаметр
0,5–1 мкм.
. ~ • •
• • •
• •
У диплококков (род Dipiococcus) клетки
располагаются попарно, так как
они делятся в одной плоскости, но потом не расходятся. К диплококкам относятся пневмококки (возбудители пневмонии); гонококки (возбудители гонореи)
и менингококки (возбудители менингита).
Стрептококки (род Streptococcus) – представляют собой цепочки клеток,
которые получаются в результате их деления в одной плоскости. При этом
клетки не расходятся, а остаются соединенными
между собой. Стрептококки
могут вызывать воспалительные гнойные процессы у человека и животных.
Тетракокки (род Tetracoccus) – клетки образуют группы по 4 особи, которые образуются при делении клеток в двух взаимноперпендикулярных плоскостях. Не патогенны. Сапрофиты.
16
Сарцины (род Sarcina) – образуют пакеты из 8–16 и более клеток, которые
получаются при делении клеток в трех взаимноперпендикулярных плоскостях.
При этом связь между клетками сохраняется. Не патогенны.
Стафиллококки (род Staphylococcus) – представлены скоплениями клеток, напоминающими виноградные гроздья. Образуются при беспорядочном
делении клеток в различных плоскостях. Патогенны для человека. Являются
причиной гнойных инфекций.
Самая многочисленная и разнообразная группа бактерий. Размеры клеток,
как правило, варьируют в широких пределах (1–10 мкм к 0,5–2 мкм) Палочковидные формы не образующие спор называют бактериями, а формы способные
при неблагоприятных условиях образовывать споры – бациллами. Взаимное
расположение большинства бактерий хаотичное, то есть после деления клетки
расходятся полностью.
У диплобактерий после деления
клетки расходятся парами (Klebsiella
pneumoniae – возбудитель пневмонии) или могут образовывать длинные цепочки (Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы ). Так же клетки могут располагаться под углом друг к другу (Corynebacterium diphtheric).
Извитые формы бактерий
Эти бактерии имеют изгибы, напоминающие спираль. Спириллы различа-
ются по количеству и характеру изгибов, общей длине и толщине клетки.
Спириллы (род Spirillum) – клетки
изогнуты на два оборота и имеют фор-
му латинской буквы S Размеры клеток достигают 15–20 мкм.
Вибрионы (род Vibrio) – представлены короткими изогнутыми палочками
в форме запятой. Клетки вибрионов слегка изогнуты и составляют 1-3 мкм.
Vibrio cholerae – возбудитель холеры.
17
Спирохеты (порядок Spirochaetales) – представлены очень тонкими длинными клетками штопорообразной формы с большим числом мелких витков
Виды родов Treponema, Borrelia, Leptospira являются возбудителями инфекционных болезней человека и животных.
Приготовление препарата «Раздавленная капля»
Водный препарат используется для изучения формы, размеров, спорообразования и подвижности микроорганизмов.
Оборудование и материалы: чашки Петри и пробирки с чистыми культу
-
рами бактерий; предметные и покровные стекла; микробиологическая петля;
спиртовка; фильтровальная бумага; 0,001% раствор метиленового синего; пипетка; микроскоп.
Ход работы.
На середину чистого предметного стекла микробиологической петлей или
пипеткой наносят каплю исследуемого раствора. Эту каплю накрывают покровным стеклом таким образом, чтобы между покровным и предметным стеклом не образовалось пузырьков воздуха. Избыток воды удаляют фильтровальной бумагой и микроскопируют. Живые бактериальные клетки можно
окрашивать 0,001–0,0001 % раствором метиленового синего или
нейтрального
красного.
Приготовление препарата «висячая капля»
Препарат «висячая капля» используется при изучении подвижности микроорганизмов, процессов размножения, спорообразования и прорастания спор.
Оборудование и материалы: чистые культуры бактерий; предметные
стекла с углублением (лункой); покровные стекла; микробиологическая петля;
спиртовка; фильтровальная бумага; микроскоп.
Ход работы.
На середину чистого покровного стекла наносят каплю исследуемой бактериальной
суспензии. Эту каплю сверху накрывают предметным стеклом с
лункой (стекло не должно касаться капли). Покровное стекло вместе с пред-
18
метным быстро переворачивают, при этом исследуемая капля оказывается висящей над углублением предметного стекла и ее можно микроскопировать.
Приготовление фиксированных препаратов
Морфологические особенности культивируемых микроорганизмов наиболее удобно изучать на фиксированных и окрашенных препаратах. Процедура
получения фиксированного препарата состоит из приготовления мазка, высушивания, фиксирования и окрашивания.
Для приготовления мазка на чистую поверхность предметного стекла
наносят суспензию клетки исследуемой культуры и распределяют ее как можно
более тонким слоем. Приготовленный
мазок высушивают при комнатной температуре и слегка подогревают над пламенем горелки. При этом происходит
фиксация бактериальных клеток на поверхности предметного стекла,
Окрашивание препарата может быть позитивным и негативным. При позитивном процессе окрашиваются клетки микроорганизмов, а при негативном пространство между бактериальными клетками.
Окраска может быть простой и сложной. При
простом способе окраски
препарат обрабатывают красящим раствором один раз. Обычно для этого применяют анилиновые красители (метиленовый синий, основной фуксин, генциановый фиолетовый, метиленовый фиолетовый). Красящий раствор наносят на
мазок на 1-2 мин. После чего препарат промывают, высушивают и микроскопируют.
Сложная дифференцированная окраска применяется для более детального
изучения структуры бактериальных клеток
и основаны на неодинаковой восприимчивости различных клеточных структур к красителям. Дифференцированные окраски играют важную роль при диагностическом исследовании бактерий.
Окраска бактерий по Граму
Окраска по Граму является важным диагностическим методом, который
позволяет разделить все бактерии на две группы - грамположительные, окрашивающиеся в сине-фиолетовый цвет - удерживающие эту
19
окраску и грамот-
рицательные, клетки, которых обесцвечиваются под действием спирта, то есть
краситель вымывается. Они окрашиваются дополнительным красителем - фуксином в красный цвет.
Оборудование и материалы: чистые культуры бактерий; предметные
стекла; микробиологическая петля; спиртовка; кристаллизатор с подставкой для
препаратов; промывалка с водой; микроскоп; 1% водный раствор генцианового фиолетового или кристаллического фиолетового; раствор Люголя;
склянка с 95% этанолом; 0,1% раствор фуксина; фильтровальная бумага
Задание.
Приготовить препарат-мазок и окрасить его по Граму. Определить какие
бактерии имеются на препарате, грамположительные или грамотрицательные.
Ход работы.
1. Мазки фиксируют на пламени горелки.
2. Окрашивают 1% раствором генцианового фиолетового в течении 1 мин.
3. Смывают раствором Люголя и заливают этим же раствором на 1–2 мин.
4. На препарат наносят несколько капель спирта на 30 сек.
5. Промывают водой, окрашивают дополнительным красителем (0,1% вод-
ный раствор фуксина) в течении 2–3 мин.
6. Препарат окончательно промывают водой, высушивают на воздухе и
микроскопируют.
Окраска спор у бактерий no методу Циля-Нильсена.
Образование спор у бактерий является важным этапом в жизненное цикле
клетки, так как способствует их выживанию в неблагоприятных условиях
внешней среды. К спорообразованию способны лишь нормально развитые,
биологически полноценные особи. Споры могут располагаться в средней части
бактериальной клетки центральное расположение (бациллярный тип); на конце
клетки – терминальное расположение (плектридиальный тип); или ближе
к од-
ному из концов – субтерминальное расположение (клостридиальный тип).
Оборудование и материалы: Молодые (24–48 часовые) культуры спорообразующих бактерий. Предметные стекла; микробиологическая петля; спир-
20
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]