Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Микробиологическая безопасность при зооантропонозных болезнях. Учебное пособие.pdf
61
происходит только в том случае, если она имеет последовательность
нуклеотидов, комплементарную первоначально адсорбированной на фильтре
молекуле ДНК.
Эффективность гибридизации определяют по количеству метки,
оставшейся на фильтре. Метод является очень чувствительным. При этом
необходимо иметь меченные радиоактивным изотопом РНК или ДНКзонды, идентификация которых с исследуемой молекулой регистрируется с
помощью радиоав тографии.
В качестве ДНК-зонда используют меченые копии ДНК с известной
последовательностью нуклеотидов.
Метод блоттинга по Саузерну. Для идентификации гена молекулу ДНКгенома расщепляют с помощью ферментов рестриктаз на куски размером
примерно по 15–20 тыс. пар нуклеотидов.
Расщепленный таким образом геном подвергается электрофоретическому
фракционированию в агарозном геле. После этого фракции ДНК денатурируют
нагреванием и переносят из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр, где
их иммобилизируют. Процесс переноса ДНК напоминает промокание и
называется методом блоттинга по Саузерну, его сущность заключается в том,
что агарозный гель помещают на фильтровальную бумагу, замоченную в
концентрированном солевом растворе, а затем на гель накладывают
нитроцеллюлозный фильтр и сверху помещают сухую фильтровальную бумагу.
Для того чтобы солевой раствор впитался в сухую бумагу, ему
необходимо пройти сквозь агарозный гель и затем через нитроцеллюлозный
фильтр. ДНК переносится вместе с солевым раствором, но задерживается
нитроцеллюлозой. Иммобилизованную таким образом ДНК можно
гибридизировать на месте с радиоактивным зондом. Со специфичным зондом
будут гибридизироваться только комплементарные ему фрагменты. Так как
62
зонд радиоактивный, то гибридизацию можно обнаружить с помощью
авторадиографии.
Каждая комплементарная последовательность проявляется в виде
радиоактивной полосы, месторасположение которой определяется размером
фрагмента ДНК.
Метод блоттинга является высокочувствительным и широко применяется
в различных областях, в том числе для диагностики инфекционных болезней
сельскохозяйственных животных, например, для обнаружения возбудителей
сибирской язвы, бруцеллеза, туберкулеза, ящура, чумы свиней, чумы птиц,
энтеровирусов и т. д.
Метод генной дактилоскопии заключается в анализе гипервариабельных
участков молекул ДНК, который включает следующие этапы: выделение ДНК и
фрагментация ее с помощью электрофореза в геле. Фрагменты, содержащие
гипервариабельные участки, выявляют авторадиографически с помощью
специального зонда — «проба Джеффриса», с которой они связываются путем
гибридизации.
В качестве радиоактивного зонда может быть использована ДНК,
выделенная из бактериофага М-13.
Метод точечной (дот) гибридизации выполняется путем внесения
исследуемых образцов ДНК в денатурированном состоянии на капроновые
мембранные фильтры в виде точек. Например, ДНК микобактерий туберкулеза
крупного рогатого скота в количестве 3 мкл (1,8 мкг/мл) в виде точек наносится
в квадраты (1,5×1,5 см). Одноцепочечные молекулы ДНК (денатурированные)
адсорбируются на мембране и фиксируются. После этого на фильтр наносится
ДНК-зонд, одноцепочечная молекула ДНК, выделенная, например, из Myc.
bovis, меченная радиоактивным фосфором.
В случае совпадения азотистые основания молекул ДНК
63
M. bovis и меченая 32Р ДНК-зонда комплементарны, т. е. происходит
связывание азотистых оснований с образованием двойной спирали. После этого
несвязанные молекулы ДНК-зонда отмываются, и образующиеся гибридные
молекулы выявляют радиоавтографически. Методика постановки ДНКгибридизации по индикации возбудителя бруцеллеза включает в себя два
основных этапа: подготовка проб исследуемого материала и приготовление
ДНК- зондов.
Подготовка проб исследуемого материала.
Берут небольшие кусочки (0,3–0,2 г) органов, тканей, гомогенизируют их
путем растирания с кварцевым песком и добавлением физиологического
раствора.
Лизис клеток проводят с добавлением 10%-ного водного раствора
додецилсульфата, доводя его концентрацию до 0,5– 1,0% и проназу до 500
мкг/мл. Смесь инкубируют при 37°С в течение 30 мин.
Добавляют равный объем смеси хлороформ-изоамилового спирта,
энергично встряхивают и центрифугируют при 10 тыс. об/мин. Верхнюю
водную фазу осторожно переносят в другую пробирку и добавляют 2,5 объема
холодного 96%-ного этанола. При этом ДНК выпадает в осадок.
Осажденную ДНК подсушивают на воздухе и растворяют в 10–20 мкл
воды.
Берут капроновый фильтр, расчерчивают на квадраты со сторонами
1,5×1,5 см и на них в несколько приемов наносят растворенный осадок,
предварительно подогретый до 100°С.
Фильтры подсушивают и выдерживают 2 ч под вакуумом при 80°С.
Фильтры с зафиксированными на них образцами можно долго хранить
при комнатной температуре в вакууме.
Приготовление ДНК-зондов.
64
Из бруцелл выделяют ДНК и озвучивают ее ультразвуком при 22 кГц в
течение 1 мин.
Полученные фрагменты ДНК метят радиоактивным фосфором методом
трансляции. Дня этого радиоактивный трифосфат (ТТР) в количестве 60 мкКюри выпаривают под вакуумом при комнатной температуре. В эту же
пробирку добавляют 5 мкл (5 мкг) озвученной ДНК, по 2 мкл всех остальных
трех немеченых трифосфатов, 4 мкл 10-ник-буфера, 2 мкл ДНК-полимеразы 1 и
2 мкл ДНК-азы, разведенной 10 тыс. раз. Все это переме- шивают и ставят на 2
ч при 15°С. Очистку зонда от невключившихся трифосфатов производят на
колонке с сефадексом Ж-50. После этого этапа зонд готов для дальнейшей
работы.
Капроновые фильтры с исследуемой ДНК запаивают в полиэтиленовые
пакеты, оставив отверстие для внесения предгибридизационной смеси.
Состав предгибридизационной смеси: формамид — 1,0 мл; 20×ССЦ (3 М,
0,3 М цитрат натрия) — 1,2 мл 100-х смеси Денхарда (1х 20-го раствора фикола,
2%-ный поливинилпирролидина, 2%-ного бычьего сывороточного альбумина)
— 0,6 мл, ДНК из спермы лосося — 0,14 мл.
ДНК из спермы лосося предварительно денатурируется кипячением при
100°С в течение 5 мин. В пакет с фильтром вносят предгибридизационную
смесь из расчета 0,5 мл на см2 фильтра и инкубируют при 46°С 2 ч.
Предгибридизационную смесь выливают, и в пакет вносят
гибридизационную смесь, состоящую из раствора, указанного в п. 3, а также
денатурированную ДНК из спермы лосося, ДНК-зонд. Смесь инкубируют при
46°С в течение 16–20 ч (оставляют на ночь).
Гибридизационную смесь выливают и отмывание фильтров проводят в
следующем режиме: в растворе состава 2×ССЦ — 0,1% ДДС 2 раза по 15 мин
при комнатной температуре, в та- ком же растворе при 60°С по 15 минут 2 раза.
65
В конце фильтры ополаскивают в 0,1×ССЦ 2 раза и высушивают при комнатной
температуре.
Для учета реакции проводят радиоавтографию или радиоактивность
определяют на счетчике.
Радиоавтографию проводят в следующем порядке: в рентгеновскую
кассету (на экран) лейкопластырем приклеивают лист обычной бумаги, на него
крепят фильтр после гибридизации и на последнюю накладывают в темноте
рентген-пленку. Рентген-кассету закрывают, помещают в полиэтиленовый пакет
и оставляют на ночь при –70°С или –20°С. После холодильника кассету
выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре, затем в темноте
вынимают пленку, проявляют и изображение закрепляют.
При наличии бруцелл в тканях в тех квадратах фильтра, куда они были
нанесены, на пленке появляются черные пятна. После установления бруцелл в
исследуемых пробах необходимо определение видовой принадлежности
бруцелл, которое проводится методом мультилокусной геномной
дактилоскопии.
KOHTPOЛЬHЫE BOПPOCЫ
В чем сущность и принципы проведения ДНК-зондов?
В чем заключается метод генной дактилоскопии?
Дайте характеристику структуры ДНК.
В чем сущность принципа комплементарности ДНК?
Преимущества ПЦР при диагностике инфекционных болезней по
сравнению с другими методами?
5. Аллергические методы диагностики
Аллергические реакции основаны на повышенной чувствительности
больного к введению в его организм дополнительной дозы чужеродного белка.
66
Такое измененное состояние организма, выражающееся в особой его
чувствительности на введение антигена (живого или убитого микроба) при
наличии живого очага инфекции в теле или перенесенного заболевания,
называется аллергией, а реакции, применяемые в целях диагностики некоторых
заразных болезней – аллергическими. Явление аллергии в ветеринарии
используется для прижизненной диагностики на туберкулез
(туберкулинизация), сап (маллеинизация) и бруцеллез (бруцеллинизация).
Ведущее место в прижизненном распознавании туберкулеза у животных
и птиц занимает аллергическая диагностика с использованием туберкулина (P.
Kox, 1890). Однако еще до Коха в России Гельман (1888-1889) изготовил
экстракт из туберкулезных бактерий и испытал его с диагностической целью на
больных туберкулезом коровах, получив положительный результат.
Диагностика с помощью туберкулина наиболее распространена в медицине и
ветеринарии. В настоящее время основным прижизненным методом
исследования животных на туберкулез служит внутрикожная туберкулиновая
проба. Туберкулин для млекопитающих изготавливавают из штаммов только
бычьего вида.
Для внутрикожной пробы применяют сухой очищенный туберкулин
(протеин пурифиед дериват ППД). ППД был предложен М. А. Линниковой для
медицинской практики. В ветеринарии используют стандартизированный сухой
очищенный туберкулин для млекопитающих, который содержит в
диагностической дозе 10 000 ± 2000 туберкулиновых единиц (TE), т е 0,2 мг
препарата, растворенного в 0,2 мл растворителя.
Сухой очищенный туберкулин (ППД) для птиц готовят по той же
технологии, что и ППД для млекопитающих - из культурального фильтрата
микобактерий туберкулеза птичьего вида и применяют для диагностики у птиц
67
и свиней Туберкулин вводят внутрикожно крупному рогатому скоту, буйволам,
зебу, верблюдам, оленям в область средней трети шеи, свиньям - наружной
поверхности основания уха, курам - в бородку.
С этой целью применяют инъекционные иглы (МРТУ № 46-84-42 или
0612), которые следует менять при каждом наполнении шприца туберкулином.
Используют и безыгольные иньекторы марки ИБВ-0,1, БИ-7 «Овод», которые
ускоряют и упрощают процесс введения туберкулина
Учитывают реакцию через 72 ч по результатам измерения толщины
кожной складки с учетом характера образовавшейся при пухлости. При
положительной реакции появляется разлитой отек размером 35 х 45 мм и
больше, без строго очерченных границ, тестообразной консистенции, с
повышенной местной температурой и чувствительностью (болезненность).
Кожная складка увеличивается на 3 мм и более. Кожную складку измеряют с
помощью кутиметра по разнице между показателем толщины возникшей
припухлости и складки неизмененного участка кожи устанавливают степень
увеличения
Курам туберкулин вводят внутрикожно в одну бородку, вторая служит
контролем. Реакцию учитывают через 30 - 36 ч. Положительная реакция
проявляется в виде опухания бородки, она уголщена, тестообразна, горячая и
отвисает книзу.
Кроме внутрикожной пробы в определенных случаях используют
глазную, подкожную и внутривенную пробы Крупный рогатый скот может быть
инфицирован возбудителем человеческого, птичьего видов,
паратуберкулезными или атипичными микобактериями. Такие животные
положительно реагируют на туберкулин млекопитающих, но не являются
туберкулезными
Такие реакции называют неспецифическими и разделяют на
парааллергические и псевдоаллергические.
68
Парааллергические реакции - результат сенсибилизации крупного
рогатого скота атипичными микобактериями, псевдоаллергические результат
воздействия возбудителей паразитарных болезней и других факторов.
Для дифференциации аллергических реакций у животных предложен
комплексный аллерген (КАМ) из атипичных микобактерий (А. Н. Шаров, 1978).
Для аллергической диагностики бруцеллеза овец, коз и свиней
используют бруцеллин ВИЭВ, приготовленный из неагглютиногенного и
авирулентного штамма В. abortus В-1. У овец и коз применяют
пальцебральную пробу, свиньям препарат вводят внутрикожно с наружной
стороны ушной раковины. У животных, больных бруцеллезом, на месте
введения бруцеллина развивается воспалительная реакция.
Для аллергической диагностики сапа применяют маллеиновую пробу
(глазную, подкожную и внутрикожную). Глазную пробу считают основным
методом диагностики сапа у лошадей (верблюдам аллерген вводят
внутривенно). Пробу выполняют двукратно с промежутком 5…6 дней. На
конъюнктиву здорового глаза утром наносят 3…4 капли маллеина. Реакцию
учитывают через 3, 6, 9 и 24 ч.
Офтальмопробу считают положительной при развитии гнойного
конъюнктивита. Конъюнктива интенсивно краснеет, набухает. Веки припухшие,
глаз закрыт. В глазной щели, по краям нижнего века, появляется шнурок гноя,
спускающийся с внутреннего угла глаза (рис. 1). Наряду с этим у некоторых
лошадей отмечают серозно-гнойное истечение из ноздри. Реакцию считают
сомнительной при интенсивном покраснении конъюнктивы, припухлости век и
слезотечении. Во внутреннем углу глаза появляется незначительное количество
(капля) гноя. При отрицательном результате офтальмопробы глаз остается
нормальным или обнаруживают легкое покраснение конъюнктивы и
69
слезотечение. В случае сомнительной реакции пробу повторяют через 5…6дней,
нанося аллерген на конъюнктиву того же глаза. Повторная реакция проявляется
через 2…5 ч и обычно бывает более резко.
Рис. 1. Положительный результат офтальмопробы при сапе (пояснение в тексте).
Подкожную пробу применяют при заболевании глаз, а также при неясных
показаниях глазной пробы. За 1 сут до введения маллеина у лошади определяют
среднесуточную температуру тела, которая не должна превышать 38,5 °С.
Для удобства наблюдения за температурной реакцией 1 мл маллеина
вводят вечером (в 22…24 ч) в подкожную клетчатку в области подгрудка или
шеи. Температуру тела начинают измерять на другой день: в 6 ч утра, т. е. через
6…8 ч после введения препарата, затем каждые 2 ч до 20 ч и, наконец, через 24
и 36 ч после введения аллергена. Исследуемую лошадь в течение 20 ч
запрещается поить холодной водой. Реакцию считают положительной, если
отмечен типичный подъем температуры до 40 °С и выше.
Внутрикожную пробу применяют в основном для полудиких табунных
лошадей. Маллеин вводят в области шеи в дозе 0,2 мл. Реакцию учитывают
через 48 ч. Пробу считают положительной, если на месте введения маллеина
развивается строго очерченная, горячая, болезненная припухлость тестоватой
консистенции размером 2х 3,5 см и больше.
70
ЛИТЕРАТУРА
1. Госманов Р.Г. Микробиология: уч.пособие / Р.Г. Госманов, А.К.
Галиуллин, А.Х. Волков.- СпБ.: Изд-во «Лань», 2011.- 496с.
2. Кисленко В.Н. Практикум по ветеринарной микробиологии и
иммунологии (+CD-ROM).- М.: Лань, 2012.-368с.
3. Колычев Н.М. Ветеринарная микробиология и иммунология /Н.М.
Колычев, Р.Г. Госманов. / 3-е издание перераб. и доп. - М.: Колос, 2003.
4. Костенко Т.С. Практикум по ветеринарной микробиологии и
иммунологии /Т.С. Костенко, В.Б. Родионова, Д.И. Скородумов. - М.: Колос,
2001.
5. СанПиН 3.3686-21"Санитарно-эпидемиологические требования по
профилактике инфекционных болезней"