Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Микробиологическая безопасность при зооантропонозных болезнях. Учебное пособие.pdf
31
При бактериологическом методе применяют по возможности среды, на
которых растет только конкретный вид бактерий — элективные среды, или
среды, позволяющие отличить предполагаемого возбудителя от других
микроорганизмов или по-другому дифференциально-диагностические среды.
При бактериологическом методе посев материала на питательные среды
производят либо стеклянным или металлическим шпателем, либо
бактериальной петлей таким образом, чтобы находящиеся в исследуемом
материале бактерии рассеять по поверхности питательной среды. В результате
такого рассеивания каждая бактериальная клетка попадает на свой участок
среды.
В том случае, если в результате бактериологического метода
исследования предполагается в исследуемом материале содержание малого
количества возбудителя, посев производят на жидкую питательную среду для
его накопления, так называемую среду обогащения, которая оптимальна для
данного микроорганизма. Далее осуществляют пересев из жидкой питательной
среды на плотные среды, разлитые в чашках Петри. Засеянную возбудителем
среду помещают в термостат обычно при определенной температуре, что важно
для бактериологического метода.
На втором этапе бактериологического метода исследования проводят
изучение колоний бактерий, выросших на плотной питательной среде и
происходящих от одной бактериальной клетки. (колония и является чистой
культурой возбудителя). Производят микроскопическое и макроскопическое
исследование колоний в отраженном и проходящем свете: невооруженным
глазом, под малым увеличением микроскопа, с помощью лупы.
Отмечают культуральные свойства колоний: их форму, величину, цвет,
характер краев и поверхности, структуру, консистенцию. Далее для
приготовления мазков используют часть каждой из намеченных колоний.
Окрашивают мазки по Граму, микроскопируют, определяя тинкториальные
32
(отношение к окраске) и морфологические свойства выделенной культуры и
проверяя одновременно ее чистоту.
Оставшуюся часть колонии пересевают в пробирки с оптимальной для
данного вида средой, например, скошенным агаром, с целью накопления чистой
культуры для более полного ее изучения. Пробирки перемещают на 18–24 часа
в термостат. На втором этапе, кроме перечисленных исследований, нередко
подсчитывают количество выросших колоний.
Для того чтобы провести такое исследование готовят последовательные
разведения взятого исследуемого материала, из которых на чашки с
питательной средой производят высев, подсчитывают количество выросших
колоний, умножают на разведение, из чего определяют содержание
микроорганизмов в материале.
Идентификация выделенной чистой культуры возбудителя и определение
для этой культуры чувствительности к антибиотикам и другим
химиотерапевтическим препаратам — третий этап бактериологичестого метода.
Идентификацию выделенной бактериальной культуры производят по
тинкториальным, морфологическим, биохимическим, культуральным,
токсигенным, антигенным свойствам.
Первым делом берут мазок из культуры, выросшей на скошенном агаре,
исследуют морфологию бактерий и проверяют чистоту культуры выросших
бактерий. Далее осуществляют посев выделенной чистой культуры бактерий на
среды Гисса. Желательно провести посев и на другие среды для определения
биохимических свойств.
С помощью реакции нейтрализации токсина антитоксином in vivo или in
vitro определяют токсинообразование микробов. В ряде случаев изучают и
другие факторы вирулентности. Вышеперечисленные исследования, которые
проводятся в бактериологической лаборатории, позволяют определить род или
вид возбудителя.
33
Метод бумажных дисков базируется на выявлении зоны подавления
размножения бактерий вокруг дисков, которые пропитаны антибиотиками. В
случае применения метода серийных разведений химический препарат —
антибиотик с жидкой питательной средой разводят в пробирках, после чего
засеивают в пробирки одинаковое количество бактерий. По отсутствию или
наличию роста бактерий проводят учет результатов. В результате
бактериологического метода исследования для определения идентичности
штаммов, полученная антибиотикограмма может служить и
эпидемиологическим целям.
Могут проводиться повторные исследования при выявлении
бактерионосительства т. к. можно не обнаружить возбудителя в одной порции
материала.
4. Серологические методы диагностики инфекционных заболеваний
Серологическая (от лат. serum — сыворотка крови) диагностика
основана на проведении различных серологических реакций. В основу
практического применения этих реакций положен принцип тесной физикохимической связи между родственными антигеном и антителом. На основании
данного принципа по одному известному компоненту можно сделать
заключение о природе другого, т. е. природе неизвестного.
Таким образом, во всех серологических реакциях участвуют два
основных компонента — антиген и антитело, реакция между которыми
осуществляется в электролитической среде. В качестве последней используют
0,85%-ный раствор поваренной
соли (физиологический раствор).
Антигены — естественные или синтетические высокомолекулярные
генетически чужеродные вещества, распознаваемые клетками организма и
вызывающие иммунный ответ в виде образования антител
34
(иммуноглобулинов Ig), появления сенсибилизированных лимфоцитов или
развитии толерантности к дан- ному антигену.
Реакции «антиген — антитело», происходящие in vivo, — это
важнейший защитный механизм устранения множества антигенов, с
которыми организм может встретиться в любой момент.
К антигенам, имеющим значение в ветеринарной микробиологии,
относят живые и убитые микроорганизмы, их структурные образования
(корпускулярные антигены), продукты их жизнедеятельности — токсины,
ферменты, продукты метаболизма (растворимые антигены).
Антигены для проявления своего действия должны быть:
генетически чужеродными;
высокомолекулярными соединениями. Это, прежде всего, белки
(полноценные антигены) и полисахариды, липополисахариды и др.
(неполноценные антигены — гаптены);
парентерально введены (попасть) в организм, т. е. минуя желудочнокишечный тракт.
Полноценные антигены способны в организме животного вызывать
образование антител (Ig), а также вступать с ними в реакцию in vitro.
Антитела — специфические белки (иммуноглобулины Ig), способные
распознавать антиген и реагировать с ним, лишая его вредного воздействия
на организм животного. Они вырабатываются зрелыми плазматическими
клетками (В-лимфоцита- ми) и поступают из лимфоидной системы в кровь.
Серологические реакции используют для:
серодиагностики — выявления в сыворотке крови больного животного
специфических антител к тому или иному антигену, микроорганизму;
сероидентификации — определения вида микроорганизма или
неизвестного антигена по известному антителу.
35
4.1. Реакция преципитации (РП)
Сущность реакции преципитации состоит в осаждении
(преципитации) антигена, находящегося в высокодисперсном состоянии,
под воздействием специфических антител находящихся в иммунной
сыворотке. В результате положительной реакции антиген переходит в
грубодисперсное состояние и образуется видимый невооруженным глазом
комплекс «антиген + антитело» в виде серо-белого диска (преципитат).
Растворимый антиген, участвующий в реакции, называется
преципитиногеном, а антитела — преципитинами.
Антитела, реагирующие с растворенным антигеном, обеспечивающие
выпадение мелкодисперсионного осадка комплекса «антиген — антитело» в
среде электролита, называются преципитинами.
Реакция является высокочувствительным тестом, с помощью которого
можно выявить наличие специфического антигена в разведении 1:100 тыс. и
более, т. е. в столь малых количествах, в которых он не обнаруживается
химическим путем. Реакция преципитации применяется для диагностики
инфекционных болезней, вызываемых как бактериями, так и вирусами.
В ветеринарии РП широко используют для исследования кожевенного
и мехового сырья, шерсти, мяса, загнившего па
тологического материала на
сибирскую язву. Это особенно важ
но, когда не представляется возможным
выделение самого возбудителя.
Бактериальные антигены, используемые для реакции преципитации,
обладают устойчивостью к высокой температуре. Так, сибиреязвенный,
чумной, туляремийный и другие антигены не разрушаются при кипячении в
течение 45 мин, они сохраняются в гниющих субстратах.
Реакция преципитации применяется также в судебной медицине и
ветеринарии для определения видовой принадлежности белка крови и в
36
ветеринарно-санитарной практике для выявления фальсификации мясных,
рыбных продуктов. С помощью этой реакции можно определить, из какого
мяса (свиного, говяжьего, конины и др.) приготовлен тот или иной продукт.
Для ее проведения разработаны методы кольцепреципитации, диффузной
преципитации, диск-преципитации.
Реакция кольцепреципитации
Эта реакция была разработана А. Асколи в 1910 г. для исследования
кожевенного сырья на сибирскую язву. Она получила также и другое название
— асколизация кожевенного сырья.
Для ее проведения необходим ряд компонентов.
Экстракт из исследуемого сырья: кусочки исследуемой кожи, нанизанные
на проволоку в виде кольца, стерилизуют в автоклаве при давлении 1,5 атм. 30
мин (для исключения заражения персонала лаборатории). Данные пробы
охлаждают, измельчают, помещают в баночки и заливают 0,3%-ным
карболизированным физиологическим раствором (на 1 г сырья — 9 мл).
Продолжительность экстрагирования составляет 16–20 ч (холодный способ).
Пробы от свиных шкур и мяса экстрагируют горячим способом в водяной
бане в течение 30 мин. Полученный материал фильтруют через асбестовую
вату. Экстракт из исследуемого сырья должен быть прозрачным, поэтому даже
при незначительном помутнении данную пробу необходимо перефильтровать.
В экстракте, полученном из кожсырья больных животных, содержится
сибиреязвенный антиген в высокодисперсном состоянии.
Сибиреязвенную преципитирующую сыворотку получают путем
гипериммунизации лошадей на предприятиях биологической промышленности.
Для этого лошадям-продуцентам внутривенно многократно (16–17 раз) вводят
возбудитель сибирской язвы (антиген) с интервалом в 3–7 дней в нарастающих
37
дозах — от 5 до 70 мл. Предварительно до гипериммунизации лошадей
вакцинируют для создания грунд-иммунитета.
Через 10–14 дней после последнего введения антигена у лошадей берут
кровь в количестве 5–6 л и отделяют преципитирующую гипериммунную
сыворотку, содержащую противосибиреязвенные антитела. Полученную
специфическую сыворотку консервируют 0,5% фенола и отстаивают в течение 2
мес., затем фильтруют через стерилизующие пластины и расфасовывают в
стерильные флаконы (объем — 50 мл) с этикетками.
0,85%-ный раствор поваренной соли (физраствор). Для контроля
используют следующие компоненты:
специфический сибиреязвенный антиген биофабричного изготовления,
который представляет собой прозрачный обезвреженный экстракт, полученный
из возбудителя сибирской язвы (в ампулах с этикеткой);
нормальная сыворотка в ампулах, фабричного изготовления, полученная
от здоровых животных.
Методы постановки реакции преципитации
Метод наслаивания: в уленгутовские пробирки наливают около 0,3 мл
преципитирующей сыворотки (по стенке, что- бы остался мокрый след), затем
осторожно по мокрому следу мелкими каплями наслаивают в таком же объеме
исследуемый экстракт (антиген) так, чтобы получилась тонкая и четкая граница
между двумя компонентами.
Метод подслаивания: в уленгутовские пробирки наливают около 0,3 мл
исследуемого экстракта (антигена), затем под него подслаивают тонко
оттянутой пастеровской пипеткой около 0,3 мл преципитирующей сыворотки.
Положительная РП характеризуется появлением в первые 1–2 мин (не
позднее 10–15 мин) на границе двух компонентов тонкого серо-белого кольца
— преципитата, состоящего из грубодисперсного комплекса «антиген +
антитело».
38
При учете реакции штатив с пробирками держат на уровне глаз и
просматривают на черном фоне в проходящем свете.
Любая серологическая реакция сопровождается контролем качества всех
компонентов:
преципитирующая сибиреязвенная сыворотка + физраствор — эталон
отрицательной реакции;
преципитирующая сибиреязвенная сыворотка + экстракт из тканей
здоровых животных — отрицательная реакция;
преципитирующая сибиреязвенная сыворотка + специфический антиген
— эталон положительной реакции;
нормальная сыворотка + экстракт из исследуемой кожи — отрицательная
реакция.
Реакция диск-преципитации
Эта реакция используется при диагностике сибирской язвы и
дифференциации ее возбудителя от подобных ему сапрофитных микробов рода
Bacillus. Она основана на взаимодействии продуктов метаболизма нативных
антигенов, растущих в жидкой питательной среде возбудителя сибирской язвы,
с антителами преципитирующей сибиреязвенной сыворотки в слое агарового
геля. При этом происходит образование диска преципитации в слое агарового
геля, расположенного между антигеном и сывороткой.
Для постановки реакции диск-преципитации необходимы следующие
компоненты:
преципитирующая сибиреязвенная сыворотка;
очищенный 1%-ный агаровый гель;
жидкая питательная среда для возбудителя сибирской язвы.
Техника проведения реакции диск-преципитации сводится к следующему:
преципитирующую сибиреязвенную сыворотку разливают по 1 мл в стерильные
39
бактериологические пробирки. На поверхность сыворотки наслаивают
расплавленный и охлажденный до 15°С 1%-ный агаровый гель столбиком высотой 5–7 мм. На поверхность застывшего агара вносят 1–1,5 мл МПБ, засеянного
исследуемой культурой. Посевы выдерживают в термостате при 37°C в течение
16–20 ч. Учет результатов проводят визуально на темном фоне.
Если исследуемая культура является возбудителем сибирской язвы, то в
средней части столбика агарового геля образуется белая линия преципитации в
виде диска с четкими границами.
Почвенные сибиреязвенные сапрофитные бациллы, за исключением
нескольких штаммов Вас. anthracoides, дают отрицательный результат (диск
преципитации отсутствует).
В качестве контроля при постановке реакции могут быть использованы
посевы, сделанные из флакона с сибиреязвенной вакциной СТИ.
Реакция диффузионной преципитации (РДП)
Эта реакция нашла широкое применение при диагностике инфекционных
болезней, для обнаружения антител в исследуемой сыворотке крови и
определения их титра, а также для установления токсигенности некоторых
видов микроорганизмов и др.
Техника проведения этой реакции сводится к следующему: из агара
фирмы «Дифко» готовится 1,5%-ный агар в физиологическом растворе (рН 7,2–
7,4) с добавлением мертиолата (1:10000) как консерванта. В стерильные чашки
Петри разливают по 20–25 мл расплавленного агара слоем 3–6 мм. После
застывания агара в его слое штампами с различным количеством пробойников
вырезают лунки на расстоянии друг от друга 4–10 мм, в которые вносят по
одной капле горячего агара для формирования дна лунки. Розлив компонентов
реакции в лунки проводится различно в зависимости от методики и
поставленных целей. Например, в центральную лунку (диаметр 16 мм) вносят
40
иммунную сыворотку, в периферическую лунку (диаметр 12 мм), исследуемые
антигены или наоборот. Чашки с поставленной реакцией выдерживают 24–72 ч
при комнатной температуре.
За это время реагенты диффундируют в агар навстречу друг другу. При
положительной реакции образуется комплекс Аг + Ат в виде линии
преципитации серо-белого цвета в месте встречи или в зоне эквивалентного
соотношения антигенов и антител. При учете реакции обращают внимание на
число линий преципитации, их расположение между лунками и относительно
друг друга. Характер взаимного расположения линий преципитации зависит от
состава анализируемых антигенов и сыворотки. Если линии преципитации
сливаются, то анализируемые антигены идентичны, если пересекаются —
неидентичны.
Эта реакция может быть осуществлена и микрометодом. В данном случае
слой агара готовят на предметных стеклах, в котором делают лунки. В
остальном эта реакция сходна с макрометодом.
KOHTPOЛЬHЫE BOПPOCЫ
Как называются компоненты в реакции преципитации?
Какова последовательность внесения компонентов при проведении РП
методом наслаивания и подслаивания?
Какие изменения претерпевает высокодисперсный антиген под действием
специфических антител в РП?
При постановке РП проведен контроль: в пробирки внесли преципитирующую сыворотку и специфический антиген. Каков бу- дет результат в
этом контроле?