Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Микробиологическая безопасность при зооантропонозных болезнях. Учебное пособие.pdf
41
4.2. Реакция агглютинации (РА)
Агглютинацией называется склеивание микробных или других клеток
при воздействии на них специфических антител в присутствии
электролитов. Двухфазный характер этого взаимодействия ничем не
отличается от механизма других двухкомпонентных реакций иммунитета:
первая фаза — специфическая, невидимая, когда происходит
взаимодействие бактерий с антителами; вторая фаза — неспецифическая, в
процессе которой изменяется физико-химическое состояние реакционной
жидкости, образуются видимые хлопья агглютината. Антиген,
вступающий в реакцию, носит название агглютиногена, антитела сыворотки
— агглютинины, а комплекс «антиген — антитело», выпадающий при
положительной реакции, — агглютинат.
Реакция агглютинации используется для серологической диагностики
многих инфекционных болезней, в том числе бруцеллеза, сальмонеллеза,
колибактериоза, сапа, листериоза, кампилобактериоза и др.
Она проводится с двумя целями:
для обнаружения специфических антител в исследуемых сыворотках;
для установления вида (серогруппы, сероварианта) выделенного
возбудителя из патологического материала с помощью известных
сывороток, содержащих специфические антитела.
Агглютинация происходит при температуре 37°С в растворе
электролитов (0,8%-ный раствор хлорида натрия), в слабо- щелочной среде
(рН 7,2–7,4).
По характеру агглютинации разделяют на два вида
Соматическую агглютинацию, когда происходит склеивание и
оседание неподвижных, не имеющих жгутиков, микробов. Эта форма О-
42
агглютинации протекает медленно, в течение 18–24 ч, и дает плотный
осадок, который при встряхивании разбивается на мелкие зерна.
Жгутиковую агглютинацию, когда происходит склеивание и оседание
подвижных, имеющих жгутики микробов. Эта форма Н-агглютинации
происходит значительно быстрее, уже через 2–4 ч, и дает рыхлый осадок,
который при встряхивании легко разбивается на крупные хлопья.
Существует множество вариантов постановки реакции агглютинации.
Наиболее распространенными методами являются: классическая,
развернутая реакция агглютинации, которая проводится в пробирках с
различными разведениями сыворотки; на предметном стекле (капельная,
пластинчатая: кровяно- капельная гемагглютинация); роз-бенгал проба
(РБП), кольцевая проба (реакция) с молоком и др.
Пробирочная РА
Для серологической диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота
в ветеринарной лабораторной практике применяется пробирочная РА,
которую ставят в объеме 1 мл.
Для постановки РА с исследуемой сывороткой необходим ряд
компонентов:
Исследуемая сыворотка крови. Кровь берут из яремной вены в пробирки с
номером индивидуально у каждого животного. В лаборатории пробирки
выдерживают для свертывания крови 45 мин при 30–37°С. Появившийся
сгусток крови отделяют от стенок стальной спицей, а затем данные пробы
помещают в холодильник при 4°С. Отстоявшуюся сыворотку отсасывают через
20–24 ч и переносят в сухие стерильные пробирки.
Исследуемые сыворотки для проведения РА, в зависимости от вида
животного, разводят физиологическим раствором согласно наставлению.
43
Известный антиген представляет собой взвесь убитых бруцелл в
физиологическом растворе в определенной концентрации (10 млрд/мл).
Бруцеллезные антигены готовят и стандартизируют на биопредприятиях,
разливают во флаконы с этикеткой.
0,85%-ный раствор поваренной соли, рН 7,2–7,4 (физ- раствор).
Для контроля качества компонентов в поставленной РА используют:
позитивную (положительную) сыворотку в ампуле, полученную
биопредприятием;
негативную (отрицательную) сыворотку крови здоровых животных в
ампуле, полученную биопредприятием.
Для исследования каждой пробы сыворотки крови требуется пять
пробирок, поставленных в первый ряд. Количество таких рядов зависит от
числа исследуемых животных. Розлив компонентов реакции проводят
индивидуальными мерными пипетками. В первой пробирке каждого ряда
готовят основное разведение 1:25. Для этого к 2,4 мл физиологического
раствора вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки. После приготовления
основного разведения сывороток в остальные пробирки (кроме второй) каждого
ряда разливают по 0,5 мл физиологического раствора. Затем из первой
пробирки с исходным разведением 1:25 переносят по 0,5 мл во вторую (пустую)
и третью пробирки, получая разведение 1:25 и 1:50. Из третьей пробирки
переносят 0,5 мл в четвертую, получая разведение 1:100, из нее в пятую по 0,5
мл, получая разведение 1:200. Из последней пробирки (1:200) излишек
жидкости — 0,5 мл — удаляют. Далее, добавив во все пробирки (кроме
исходной) по 0,5 мл фабричного антигена, разведенного 1:10, получают ряд из
четырех пробирок со следующим разведением исследуемых сывороток: 1:50,
1:100, 1:200, 1:400 в объеме по 1 мл.
Первая пробирка с исходным разведением сыворотки 1:25 остается без
антигена и служит контролем качества сыворотки. При наличии хлопьев,
44
фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты агглютинации не
учитываются.
При постановке РА одновременно с исследуемыми сыворотками ставят
три контроля:
с негативной (отрицательной) сывороткой в тех же разведениях, как и с
исследуемыми;
с позитивной (положительной) сывороткой в разведениях до ее
предельного титра;
контроль антигена (0,5 мл физиологического раствора с 0,5 мл
разведенного антигена) для исключения спонтанной агглютинации.
После розлива всех компонентов штативы с пробирками осторожно
встряхивают и помещают в термостат при 37–38°С на 16–20 ч, затем
выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет
реакции.
Результаты реакции учитывают визуально и определяют ее степень в
плюсах по следующей схеме:
(++++) — полное просветление жидкости; на дне осадок в виде «зонтика»,
при легком встряхивании осадок разбивается на мелкие зерна, а жидкость
остается прозрачной (100%-ная агглютинация);
(+++) — неполное просветление жидкости; «зонтик» хорошо выражен,
при встряхивании появляются мелкие зерна (75%-ная агглютинация);
(++) — незначительное просветление жидкости; «зонтик» умеренно
выражен, при встряхивании появляются мелкие зерна (50%-ная агглютинация);
(+) — едва заметное просветление жидкости; «зонтик» выражен слабо,
при встряхивании заметно небольшое количество зерен (25%-ная
агглютинация);
(–) — просветление жидкости; образование «зонтика» не произошло, на
дне пробирки видна «пуговка» осевших микробов, при легком встряхивании
45
образуется равномерная взвесь. За титр антител принимают последнее
разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем на два
плюса (++).
Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с
сывороткой крупного рогатого скота с оценкой не менее чем два плюса (++) в
разведении 1:100 и выше.
Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в
разведении 1:50 с сыворотками крупного рогатого скота с оценкой не менее чем
на два плюса (++).
При получении сомнительных результатов сыворотки крови животных
повторно исследуют через 3–4 нед.
Капельный метод РА применяют в основном для идентификации
культур бактерий, а также для установления их принадлежности к
определенным серогруппам и серовариантам.
Техника постановки РА сводится к следующему: на предметное стекло
раздельно наносят 2 капли — каплю известной агглютинирующей
диагностической сыворотки (из флакона с этикеткой) и каплю
физиологического раствора (контроль). Бактериологической петлей снимают с
агара часть изучаемой бактериальной культуры, петлю увлажняют в капле
сыворотки, затем культуру рядом с каплей растирают до гомогенного
состояния, смешивают с сывороткой и, слегка покачивая, осторожно
подогревают в пламени спиртовки до 37°С (не более). Если сыворотка и
бактериальная культура специфичны друг другу, агглютинация наступает в
ближайшие 2–3 мин. Агглютинация проявляется в виде склеивания
бактериальных клеток и полного (или частичного) просветления жидкости в
капле.
46
В контрольной капле — физраствор + антиген — реакция агглютинации
не происходит, капля остается равномерно мутной (здесь контролируют
качество компонентов и возможность самоагглютинации).
Реакцию агглютинации учитывают при хорошем освещении, применение
лупы облегчает учет реакции.
Реакция гемагглютинации (РГА)
Эта реакция не относится к реакциям иммунитета, так как является
результатом действия естественных гемагглютининов некоторых бактерий и
вирусов на эритроциты, что влечет за собой их агглютинацию.
Данную реакцию ставят на плексигласовых панелях с лунками. Готовят
ряд разведений исследуемого материала в физрастворе и к ним добавляют
равный объем 1–2%-ной взвеси эритроцитов, после чего панели с реакцией
помещают в термостат на 30 мин или оставляют при комнатной температуре на
1 ч.
Учет реакции производят по характеру осадка. При положительной
реакции осадок из склеившихся эритроцитов имеет форму раскрытого
«зонтика» с изрезанными краями, а при отрицательной — осадок в виде диска
(кнопки) с ровными краями.
Реакция гемагглютинации позволяет выявить только наличие и
концентрацию бактерий (вирусов), обладающих гемагглютинирующей
способностью. Для идентификации этих микроорганизмов в дальнейшем
применяют реакцию торможения гемагглютинации (РТГА).
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
Реакция торможения гемагглютинации относится к иммунным реакциям,
в которой специфические антитела, взаимодействуя с антигеном, лишают его
способности агглютинировать эритроциты.
47
Реакция проводится в два этапа. На первом этапе готовят ряд разведений
специфической сыворотки от 1:10 до 1:1280; к каждому разведению сыворотки
добавляют равный объем жидкости, содержащий антиген в четырехкратном
титре, который определен в предварительно поставленной РГА. При этом, если
произошла полная агглютинация эритроцитов антигеном в разведении 1:640,
для дальнейшей работы применяют антиген в 4 раза концентрированнее, т. е. в
разведении 1:160.
На втором этапе, после инкубирования при 37°С в течение 30 мин к этой
смеси добавляют равный объем 1–2%-ной взвеси эритроцитов. Если сыворотки
и антигена взято по 0,25 мл, то добавляют 0,5 мл эритроцитов.
Контролем является проба, где сыворотка заменена физраствором.
Реакция читается после выдерживания в течение 30 мин в термостате или 45
мин при комнатной температуре.
При положительной РТГА на дне пробирки образуется плотный осадок
эритроцитов (задержка реакции), имеющий вид «пуговки» или диска.
При отрицательной РТГА отмечается выраженная гемагглютинация в
виде «зонтика».
Реакция используется для идентификации и типизации выделенного
антигена, титрования вируссодержащих жидко- стей и серологической
диагностики вирусных инфекций.
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА)
Сущность этой реакции заключается в том, что антиген или антитела
(иммуноглобулины) адсорбируют на поверхность эритроцитов, которые
приобретают способность агглютинироваться в присутствии специфических
антител или антигена.
48
Главными достоинствами РНГА являются высокая чувствительность и
специфичность, техническая простота, стабильность используемых
компонентов.
РНГА применяют при диагностике инфекционных болезней:
для обнаружения и титрования антител в исследуемой сыворотке крови с
помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
для идентификации неизвестного антигена с помощью известного
иммуноглобулинного (антительного) эритроцитарного диагностикума.
Учет РНГА проводится так же, как и при постановке РГА.
KOHTPOЛЬHЫE BOПPOCЫ
С какой целью применяется РА?
Как называются компоненты, участвующие в РА?
Какие изменения претерпевает корпускулярный антиген под действием
специфических антител в РА
4.3. Реакция связывания комплемента (РСК)
РСК, как и все серологические реакции, может быть использована в
следующих направлениях:
для выявления специфических антител в сыворотке крови больных
животных с включением в реакцию известного антигена при диагностике
бруцеллеза, сапа, листериоза, лептоспироза и др.;
для индикации или определения в исследуемом материале
специфического антигена с использованием известных иммунных
сывороток.
Сущность РСК заключается в том, что при взаимодействии антитела со
специфическим для него антигеном происходит процесс связывания
49
комплемента на образовавшемся комплексе, который визуально не
проявляется. Для выявления связывания комплемента с комплексом
«антиген — антитело» вводится гемолитическая система (ее называют
индикаторной), состоящая из гемолитической сыворотки (гемолизина) и
эритроцитов барана.
Если антиген и антитело, взятые для исследования, специфичны, то
происходит полное связывание комплемента, и гемолиз эритроцитов в
гемолитической системе не происходит. На дне пробирки после инкубации в
течение 20 мин при 37°С и последующем выдерживании смеси в течение 20–
24 ч при комнатной температуре образуется осадок негемолизированных
эритроцитов.
Если же антиген и антитело неспецифичны, то комплекс,
связывающий комплемент, не образуется, последний остается в свободном
состоянии и отклоняется в гемолитическую систему, вследствие чего
наступает гемолиз эритроцитов, и исследуемая смесь приобретает красный
лаковый цвет. РСК, как и другие реакции иммунитета, протекает при
строгих количественных соотношениях, взятых в опыт компонентов и точно
оттитрованных количествах комплемента, гемолитической сыворотки,
антигена и антител.
Существуют различные модификации реакции связывания
комплемента, мы представляем методику постановки РСК при диагностике
бруцеллеза. Реакция проходит в водяной бане при 37–38°С в объеме 1 мл (по
0,2 мл каждого компонента — сыворотки, антигена, комплемента,
гемолизина и эритроцитов).
При диагностике сапа и других болезней РСК ставится в объеме 2,5
мл, поэтому каждый из компонентов, входящих в реакцию, берется в объеме
0,5 мл.
50
Для серологической диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота
в ветеринарной лабораторной практике применяется РСК, которую ставят в
объеме 1 мл.
KOHTPOЛЬHЫE BONPOCЫ
С какой целью при постановке РСК исследуемую сыворотку
инактивируют?
При постановке главного опыта РСК на бруцеллез в одной из проб
«нет гемолиза». Дайте диагностическую оценку реакции.
При титровании гемолизина установлен предельный титр 1:2000, назовите
рабочий титр гемолизина.
При постановке РСК на бруцеллез с сывороткой крови больного
животного допущена неточность: в пробирку внесено комплемента больше, чем
установлено при титровании. К каким результатам может привести эта
оплошность (ПГ, ЧГ, НГ)?
Почему при постановке РСК возникает необходимость во второй
гемолитической системе
В серологических реакциях — МФА и ИФА — используют антитела,
меченные флуорохромами или ферментами, в процессе постановки этих
реакций, применяя специальные методы исследования, четко фиксируется
образование иммунного комплекса. В некоторых методах ИФА ферментную
метку вводят в антиген.
4.4. Методы флуоресцирующих антител (МФА)
Эти методы основаны на принципе серологических реакций, когда
происходит взаимодействие специфического антигена со специфическими
антителами, с образованием иммунного комплекса, но антитела здесь
предварительно мечены флуорохромом (изотиоционатфлуоресцеином).