Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биополимеры в супрамолекулярных системах. Учебно-методическое пособие
.pdf
61
раствора в зависимости от рH среды. Как отмечалось выше, светопропускание раствора белка в ИЭТ минимально. Это связано с тем, что
макромолекула белка принимает свернутую конформацию вследствие
того, что взаимное притяжение противоположно заряженных ионогенных групп преобладает над взаимным отталкиванием групп, заряженных одинаково. При изменении рH среды наблюдается увеличение
светопропускания раствора белка.
Порядок выполнения работы
В шести пронумерованных пробирках приготовить буферные
смеси с разным значением рН (табл. 1). Содержимое пробирок взболтать и в каждую добавить по 0,5 мл раствора казеина (0,1 %).
После этого смесь в пробирках снова встряхнуть и отметить помутнение раствора. В каждую пробирку добавить по 2 мл этилового
спирта и оценить степень мутности проб. Результаты свести в табл. 2,
отмечая степень мутности раствора до и после добавления этилового
спирта по пятибалльном шкале: 1 – отсутствие помутнения, 2 – слабое, 3 – умеренное, 4 – сильное, 5 – очень сильное.
Таблица 1
Приготовление буферных систем
№
Состав буферной смеси (мл)
рН
0,2М СН3СООН
О,2М СН3COONa
1
1,9
0,1
3,4
2
1,8
0,2
3,8
3
1,4
0,6
4,4 4 1,0
1,0
4,7
5
0,6
1,4
5,1
6
0,2
1,8
5,7
Таблица 2
рH
Зависимость степени мутности раствора казеина
до добавления спирта
после добавления спирта
3,4
3,8
4,4
4,7
5,1
5,7
ИЭТ белка находят на основе анализа степени мутности как
62
значение рH, при котором отмечается очень сильное помутнение раствора казеина.
Нахождение ИЭТ для индивидуальных белков позволяет подобрать условия для осаждения их из биологических экстрактов, содержащих смесь разных белков.
63
Л а б о р а т о р н а я р а б о т а 3
И С С Л Е Д О В А Н И Е Д Е Н А Т У Р А Ц И И Б Е Л К О В
Цель работы: изучение закономерностей денатурации белков.
Материалы и реактивы: 1 % раствор яичного белка, 1 % рас-
твор сульфата меди, концентрированная азотная кислота, раствор уксусной кислоты (0,24 М), концентрированная уксусная кислота, 10 %
раствор NaOH, дистиллированная вода.
Оборудование: штатив с пробирками, капельницы или пипетки,
спиртовки, держатели для пробирок.
Контрольные вопросы: денатурация белков и ее причины; изменение физико-химических свойств белков под действием денатурации; основные денатурирующие факторы; необратимая денатурация;
механизм тепловой денатурации; применение явления денатурации в
биохимических исследованиях.
Теоретическое введение
Вещества, нарушающие структурную организацию белковой
молекулы (т. е. четвертичную, третичную и даже вторичную структуры), приводят к изменению физико-химических и биологических
свойств белка. Это явление называется денатурацией. Денатурация
существенно изменяет растворимость макромолекул биополимера.
Белок становится менее гидрофильным и легко осаждается. Денатурация чаще всего необратима, но в ряде случаев удаление денатурирующих факторов приводит к восстановлению исходной конформации
молекулы белка и его природных свойств. Необратимую денатурацию
белков вызывают соли тяжелых металлов, минеральные и органические кислоты, алкалоиды, кипячение и др.
Явление денатурации белков используют в биохимических исследованиях: а) для осаждения белка в исследуемом биологическом
материале с целью дальнейшего определения в нем низкомолекулярных соединений; б) для выявления присутствия белка и его количественного определения.
64
Порядок выполнения работы
1. Денатурация белка солями тяжелых металлов
Метод основан на связывании ионов тяжелых металлов с функциональными группами боковых радикалов аминокислот в молекуле
белка, в результате чего разрушается ее пространственная структура и
происходит осаждение денатурированного белка. При добавлении избытка солей тяжелых металлов (кроме AgNO3 и HgCl2) происходит
растворение первоначально образующегося осадка из-за адсорбции
иона металла и приобретения вследствие этого белковой молекулой
положительного заряда.
Свойство белков прочно связывать ионы тяжелых металлов используется в медицинской практике: белки применяют в качестве противоядия при отравлении солями ртути, свинца, меди и других металлов. Сразу после отравления обычно применяют белки молока или
яиц, пока еще эти соли находятся в желудке и не успели всосаться.
Вслед за принятием белка у больного вызывают рвоту, чтобы удалить
яд из организма.
К 1 мл раствора яичного белка прилить 1–2 капли раствора
сульфата меди. Выпадает осадок, не растворяющийся при добавлении
воды.
2. Денатурация белка концентрированными минеральными кис-
лотами
Метод основан на способности минеральных кислот вызывать
нейтрализацию зарядов и разрушение пространственной структуры
белка, что приводит к его денатурации и осаждению. Ортофосфорная
кислота осадка не дает. При избытке всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший осадок белка растворяется (за счет перезарядки белка). Качественная реакция с концентрированной азотной
кислотой лежит в основе количественного определения белка в моче.
В пробирку налить 1 мл концентрированной азотной кислоты и
осторожно, держа пробирку под углом 45°, добавить в нее 1 мл раствора яичного белка. На границе двух слоев жидкостей образуется
осадок в виде небольшого белого кольца.
3. Тепловая денатурация белка.
Почти все белки денатурируют при нагревании (50–55 °С и выше). Механизм тепловой денатурации связан с перестройкой структуры белковой молекулы, в результате которой белок теряет свои природные свойства, уменьшается его растворимость. При выпадении
в осадок денатурированного при нагревании белка важную роль игра-
65
ет концентрация ионов водорода. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в ИЭТ белка.
В сильно кислых (за исключением азотной, трихлоруксусной и
сульфосалициловой кислот) и сильно щелочных растворах денатурированный при нагревании белок не выпадает в осадок, так как молекулы белка перезаряжаются (или происходит усиление имеющегося заряда) и несут в первом случае положительный, а во втором случае отрицательный заряд. Это повышает их устойчивость в растворе в результате электростатических сил отталкивания.
В четыре пронумерованные пробирки налить по 10 мл 1 % раствора яичного белка. Содержимое первой пробирки нагреть. Жидкость
помутнеет, но так как частицы денатурированного белка несут заряд,
они удерживаются во взвешенном состоянии (яичный альбумин является кислым белком и в нейтральной среде заряжается отрицательно).
В пробирку 2 добавить 1 каплю раствора уксусной кислоты
(0,24 М) и нагреть. Выпадает осадок белка вследствие того, что подавляется кислотная диссоциация и белок приближается к изоэлектрическому состоянию.
В пробирку 3 добавить 1 каплю концентрированной уксусной
кислоты и содержимое нагреть. Осадка белка не образуется даже при
кипячении, так как в сильнокислой среде молекулы белка перезаряжаются, приобретая положительный заряд.
В пробирку 4 добавить 1 каплю 10 % раствора гидроксида натрия
и нагреть. Осадок белка не образуется даже при кипячении, так как
в щелочной среде отрицательный заряд на частице белка усиливается.
66
Л а б о р а т о р н а я р а б о т а 4
И З У Ч Е Н И Е В Л И Я Н И Я Ф Е Р М Е Н Т А А М И Л А З Ы
НА Г И Д Р О Л И З К Р А Х М А Л А
Цель работы: исследование влияния фермента амилазы на гид-
ролиз крахмала и воздействия активаторов и ингибиторов на активность амилазы.
Материалы и реактивы: 0,2 % раствор крахмала, 0,1 % раствор йода в 0,2 % растворе KJ, 1 % раствор NaCl, 1 % раствор CuSO4,
дистиллированная вода, раствор слюны – рот ополаскивают 2–3 раза
водой для удаления остатков пищи, отмеряют цилиндром 50 мл дистиллированной воды и ополаскивают рот в течение 3–5 мин в несколько приемов, собранную жидкость фильтруют через бумажный
фильтр и фильтрат используют в качестве источника фермента.
Оборудование: штатив с пробирками, пипетки, капельницы,
термостат.
Контрольные вопросы: ферменты – биологические катализа-
торы; сходство и различия ферментов и катализаторов, применяемых в
химии; специфичность действия ферментов; сближение и ориентация
субстрата и фермента; активаторы и ингибиторы ферментов; классификация и номенклатура ферментов; зависимость скорости реакции от
температуры и рН среды.
Теоретическое введение
Амилаза – гидролитический фермент (относится к группе гидролаз), расщепляющий полисахариды (крахмал, гликоген, инулин) до
олигосахаридов. Исторически амилаза стала первым открытым ферментом, когда французский химик А. Пайен описал в 1833 г. диастазу – фермент (на самом деле, смесь ферментов), расщепляющий крахмал до мальтозы. Согласно другим данным, амилазу в 1814 г. открыл
академик Петербургской Академии наук К. С. Кирхгоф. Именно амилаза приводит к появлению сладковатого вкуса при длительном пережевывании крахмалосодержащих продуктов (например, из риса или
картофеля), но без добавления сахара.
По субстратной специфичности амилазы классифицируют на
альфа-, бета- и гамма-амилазу.
67
α-Амилаза (1,4-α-D-глюкан-глюканогидролаза, гликогеназа) является кальций-зависимым ферментом. К этому типу относятся амилаза слюнных желез и амилаза поджелудочной железы. Она способна
гидролизовать полисахаридную цепь крахмала и других длинноцепочечных углеводов в любом месте. Таким образом, процесс гидролиза
ускоряется и приводит к образованию олигосахаридов различной длины. Схематически действие α-амилазы на крахмал можно представить
следующим образом:
Активность α-амилазы оптимальна в нейтральной среде
(pH = 6,7–7,0). Фермент обнаружен также у растений (например,
в овсе), в грибах (в аскомицетах и базидиомицетах) и бактериях
(Bacillus).
β-Амилаза (1,4-α-D-глюкан-мальтогидролаза) присутствует у бактерий, грибов и растений, но отсутствует у животных. Она отщепляет
вторую с конца α-1,4-гликозидную связь, образуя таким образом дисахарид мальтозу. При созревании фруктов β-амилаза расщепляет плодовый крахмал на сахара, что приводит к сладкому вкусу зрелых плодов. В семенах β-амилаза активна на стадии, предшествующей прорастанию, тогда как α-амилаза важна непосредственно при прорастании
семени.
γ-Амилаза (1,4-α-D-гликан-глюкогидролаза, лизосомальная α-глюкозидаза) отщепляет последнюю α-1,4-гликозидную связь, приводя
к образованию глюкозы. Кроме этого, γ-амилаза способна гидролизовать α-1,6-гликозидную связь. В отличие от других амилаз, γ-амилаза
наиболее активна в кислых условиях (при pH = 3).
У человека α-амилаза является основным пищеварительным
ферментом. Благодаря этому же ферменту глюкоза усваивается организмом. Амилаза слюнных желез начинает этот процесс и может фактически совершить переваривание значительной части крахмала до поступления его в тонкую кишку и контакта с панкреатической амилазой.
Порядок выполнения работы
68
1. Действие амилазы
Как отмечено выше, амилаза катализирует гидролиз α-глюкозидной связи α-1-4-крахмала и гликогена до промежуточных продуктов, именуемых декстринами. Крахмал обладает способностью образовывать с йодом соединение синего цвета, амилодекстрин – фиолетового, эритродекстрин – красно-бурого и ахродекстрин – желтого.
В две пробирки внести по 5 мл крахмального клейстера, в одну
из них добавить 0,5 мл раствора слюны, содержащей амилазу. Хорошо
все перемешать и оставить стоять. Через 15 мин в обе пробирки прибавить по 5 капель раствора йода. В пробирке с амилазой слюны раствор через некоторое время становится бесцветным, в пробирке без
амилазы цвет раствора не изменяется, т. е. остается сине-фиолетовым.
2. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы
Активатором амилазы является NaCl, а ингибитором – CuSО4.
О влиянии этих солей на активность амилазы судят по степени гидролиза крахмала под влиянием фермента в присутствии NaCl и CuSO4.
Приготовить три пробирки. В первую налить 2,5 мл воды, во
вторую – 2 мл воды и 0,5 мл раствора NaCl, в третью – 2 мл воды и
0,5 мл раствора CuSO4. Во все пробирки внести по 2,5 мл раствора
слюны, перемешать и добавить по 2,5 мл раствора крахмала. Затем
снова перемешать и поставить в термостат при t = 38 ºС. Через 5 мин
прибавить по 5 капель раствора йода.
Жидкость в первой пробирке окрашивается в фиолетовый или
красный цвет, во 2-й пробирке – в красный или желтый (активация),
в 3-й – в синий (ингибирование).
69
Л а б о р а т о р н а я р а б о т а 5
О П Р Е Д Е Л Е Н И Е К Р И Т И Ч Е С К О Й К О Н Ц Е Н Т Р А Ц И И
А С С О Ц И А Ц И И П А В С Х И Т О З А Н О М
Цель работы: изучение закономерностей формирования комплексов биополимер – ПАВ; определение критической концентрации
ассоциации ПАВ с полиэлектролитом методом зондовой флуоресцентной спектроскопии.
Материалы и реактивы: 2 ∙ 10–2 М раствор додецилсульфата
натрия (ДДС), раствор катионного полиэлектролита хитозана (ХТЗ) с
концентрацией 0,05 г/дл (2,4 ∙ 10–3 осново-моль/л), этанол, флуоресцентный зонд – пирен, дистиллированная вода.
Оборудование: люминесцентный спектрофлуориметр Cary
Eclips (Varian), магнитная мешалка, пипетки, микрошприцы.
Контрольные вопросы: полиэлектролит; поверхностно-активное вещество; полимер-коллоидный комплекс; механизм образования
комплекса; критическая концентрация ассоциации; количественные
характеристики связывания ПАВ полиэлектролитом (степень связывания, константа диссоциации комплекса).
Теоретическое введение
Развитие супрамолекулярной химии позволило синтезировать
разнообразные химические системы, представляющие собой организованные композиции молекул, объединенные как ковалентными связями, так и нековалентными межмолекулярными силами.
Основной объем химических процессов, в том числе процессы
самоорганизации, протекает в растворах. Ассоциативные взаимодействия в растворах полимеров и ПАВ являются классическим примером самоорганизации, приводящей к формированию высокоорганизованных супрамолекулярных структур – полимер-коллоидных комплек-
сов (ПКК). Процесс формирования, свойства и фазовое поведение
комплексов полимер – ПАВ можно регулировать с помощью различных факторов, таких как химическая природа полимера, структура
ПАВ, состав растворителя, ионная сила раствора, pH, температура.
Это позволяет относить комплексы к классу так называемых «умных
полимеров» и обусловливает их широкое применение в качестве мо-
70
делей биологических систем, компонентов лекарственных средств,
флокулянтов, высокоэффективных катализаторов.
Хитозан является практически единственным поликатионом
природного происхождения. Наличие положительного заряда способствует проникновению макромолекул хитозана через клеточные мембраны и плотные слои эпителия и обеспечивает адгезию к слизистым
оболочкам и противомикробные свойства. Полиэлектролитная природа хитозана, обусловленная наличием протонированных аминогрупп,
обеспечивает также его способность к комплексообразованию с противоположно заряженными полиэлектролитами и поверхностноактивными веществами (ПАВ) в водных средах.
Полиэлектролит – это полимерное соединение, имеющее в сво-
ем составе функциональные группы, способные в определенных условиях к электролитической диссоциации. Эти функциональные группы
называют ионогенными. В растворе полиэлектролита полимерная цепь
содержит заряженные группы, а в окружающей среде присутствуют
низкомолекулярные ионы противоположного знака – противоионы.
Наличие в растворе полимерного макроиона хитозана и противоположно заряженных ионов ПАВ обусловливает возникновение
между ними сильного электростатического притяжения. В результате
происходит перенос ионов ПАВ из объема раствора в область, занятую макромолекулой, причем концентрация ПАВ в данном микрообъеме может значительно превысить критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ).
Процесс взаимодействия хитозана с противоположно заряженными ионами ПАВ можно описать реакцией обмена, в результате которой образуется комплекс хитозан – ПАВ и наблюдается выделение в
раствор низкомолекулярных противоионов согласно схеме на рис. 1.
С увеличением концентрации связанного ПАВ достигаются условия
для формирования мицеллоподобных кластеров в объеме, ограниченном размерами макромолекулярного клубка, по гидрофобному меха-
низму.
Рис. 1. Схема электростатического взаимодействия хитозана
с противоположно заряженными ионами ПАВ
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]