Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Биополимеры в супрамолекулярных системах. Учебно-методическое пособие
.pdf
3K4[Fe(CN)6] + 4 FeCl3 → 2Fe4[Fe(CN)6]3 + 12KCl.
Берлинская лазурь
C6H8O6 +
O
Cl
Cl
N
ONa
+ HCl
2,6-дихлорфенолиндофенол,
синий в щелочной среде
C6H6O6 +
HO
Cl
Cl
HN
OH
+ NaCl
.
Восстановленный 2,6-дихлорфенолиндофенол, бесцветный
KJO3 +5KJ +6HCl →3J2+6KCl+3H2O
O
OH HO
H
CHOH
CH2OH
O
+ J
2
O
O O
H
CHOH
CH2OH
O
+2HJ
Аскорбиновая кислота
(восстановленная форма)
Аскорбиновая кислота
(окисленная форма).
51
Реакция восстановления 2,6-дихлорфенолиндофенола:
Принцип метода количественного определения витамина С основан на его способности восстанавливать молекулярный йод с образованием йодистоводородной кислоты:
Количественное определение витамина С проводят, титруя исследуемый раствор, подкисленный соляной кислотой в присутствии
крахмала, раствором йодата калия.
52
Л а б о р а т о р н а я р а б о т а 1
А Н А Л И З А М И Н О К И С Л О Т Н О Г О С О С Т А В А Б Е Л К О В
Цель работы: овладение методами анализа аминокислотного
состава белков с помощью цветных реакций.
Материалы и реактивы: 1 % раствор яичного белка, 10 % раствор NaOH, 1 % раствор сульфата меди, концентрированная азотная
кислота, реактив Миллона (в 57 мл концентрированной азотной кислоты растворяют 40 г ртути сначала на холоде, а затем, слабо нагревая, на водяной бане. Полученный раствор разбавляют двумя объемами воды, дают отстояться и сливают с осадка), концентрированная уксусная кислота, 5–10 % раствор уксуснокислого свинца, дистиллированная вода.
Оборудование: штатив с пробирками, капельницы или пипетки,
держатели для пробирок, спиртовки.
Контрольные вопросы: аминокислотный состав белков; цветные реакции на белки и причины их возникновения; биуретовая реакция; ксантопротеиновая реакция; реакция Миллона; реакция Адамкевича; реакция Фоля; обнаружение в белке аргинина с помощью цветных реакций; обнаружение в белке цистеина; гидролиз белков.
Теоретическое введение
При взаимодействии белка с отдельными химическими веществами возникают окрашенные продукты реакции. Образование их
обусловлено присутствием в молекуле белка определенной химической группировки, обусловливающей ход реакции. Поэтому и вещества небелковой природы, но имеющие те же химические группировки, могут давать эти реакции.
Различают и так называемые универсальные цветные реакции,
свойственные всем белкам – это биуретовая и хингидриновая реакции.
По цветным реакциям можно доказать белковую природу вещества, обнаружить наличие или отсутствие отдельных аминокислот.
Кроме того, разработаны методы количественного определения белков
и аминокислот, в основе которых лежат цветные реакции.
53
Порядок выполнения работы
1. Биуретовая реакция
Биуретовая реакция является универсальной на пептидную
связь в белках. Вещества, имеющие в своем составе не менее двух
пептидных связей , дают эту реакцию.
Реакция состоит в том, что в щелочной среде в присутствии
сульфата меди белки и полипептиды дают сине-фиолетовое или красно-фиолетовое окрашивание в зависимости от длины пептида вследствие образования комплексных соединений меди с пептидной группой. Продукты гидролиза белков (пептоны) могут давать розовое,
красное окрашивание.
Названа эта реакция так, потому что ее дает биурет, содержащий также пептидные связи. Биурет, имеющий две группировки
, образуется при нагревании сухой мочевины с отщепле-
нием аммиака:
NH
2
C O
NH
2
NH
2
C O
NH
2
NH
3
+
NH
2
C O
C O
NH
2
NH
2
Мочевина
Биурет
Группа, образующая пептидную связь
CO NH
, в щелочной
среде присутствует в своей таутомерной енольной форме:
C
O
N
H
C N
OH
.
Щелочная среда приводит к появлению отрицательного заряда
вследствие диссоциации ОН-группы, благодаря этому кислород взаимодействует с медью с образованием солеообразной связи, а медь,
в свою очередь с атомами азота связана через дополнительные координационные связи за счет использования их неподеленных электрон-
CO NH
CO NH
54
ных пар. Это ведет к образованию стабильного комплекса. Схематично реакцию можно представить так:
H
N
CH C
R
1
O
H
N
CH C
R
2
O
H
N
CH C
R
3
O
H
N
CH C
R
4
H
N
O
N CH C
R
1
OH
N CH C
R
2
OH
N CH C
R
3
OH
N CH C
R
4
N
OH
+2NaOH+Cu(OH)
2
4H2O +
N CH C
R
1
O
N CH C
R
2
O
N CH C
R
3
ONa
N CH C
R
4
N
ONa
Cu
Биуретовый комплекс
В пробирку налить 1 мл раствора белка, 1–2 мл 10 % NaOH и 1–
2 капли 1 % раствора сульфата меди. При взбалтывании появляется
фиолетовое окрашивание. Образуется Сu•Na протеинат. Проделать тот
же опыт, заменив NaОН чистой водой.
2. Ксантопротеиновая реакция
Ксантопротеиновая реакция определяет наличие в белках циклических аминокислот: триптофана, фенилаланина, тирозина, содержащих в своем составе бензольное ядро. Реакция носит название от греческого слова Xanthos – желтый. Ряд белков при добавлении к ним концентрированной азотной кислоты при нагревании дают желтое окрашивание, которое может переходить в оранжевое в щелочной среде.
Реакция вызвана нитрованием бензольного ядра указанных циклических аминокислот. При этом образуются нитросоединения желтого цвета.
C
HC
HC
C
OH
CH
CH
H2C
H
C
COOH
NH
2
HNO
3
C
C
HC
C
C
OH
CH
H2C
H
C
COOH
NH
2
NO
2
NO
2
тирозин
динитротирозин (желтого цвета)
55
При подщелачивании возникает хиноидная структура, окрашенная в оранжевый цвет.
C
CH
C
C
C
HC
O
O2N N
OH
O
H2C
H
C
COOH
NH
2
NaOH
C
CH
C
C
C
HC
O
O2N N
ONa
O
H2C
H
C
COOH
NH
2
хиноидная форма
динитротирозина
Натриевая соль
динитротирозина
хиноидной структуры
(оранжевого цвета)
Аналогично протекает реакция нитрования триптофана и тирозина.
Ксантопротеиновую реакцию дают почти все белки. Ксантопротеиновая реакция обусловливает появление желтого окрашивания при
попадании концентрированной азотной кислоты на кожу, ногти. Эту
реакцию могут давать и более простые ароматические соединения
(например, фенолы). Исключение составляют клупеин, сальмин (из
группы протаминов) и желатина, в молекуле которых почти полностью отсутствуют ароматические аминокислоты.
К раствору белка объемом 1 мл прилить 5–6 капель концентрированной азотной кислоты. Белок при этом должен выпасть в осадок.
При осторожном подогревании раствор окрашивается в желтый цвет.
После охлаждения в пробирку налить по каплям 10 % раствор гидроксида натрия до появления оранжевого окрашивания вследствие образования натриевой соли динитротирозина.
3. Реакция Миллона
Реакция Миллона характерна для белков, содержащих ароматическую аминокислоту тирозин. При взаимодействии белка с реактивом Миллона образуется осадок белка, который при нагревании окрашивается в красно-коричневый цвет.
Реакция вызвана присутствием в белке фенольной группы тирозина, после взаимодействия которой с реактивом Миллона образуется
ртутная соль нитропроизводного. Реакцию Миллона дают все белки,
за исключением тех, молекулы которых не содержат тирозин (жела-
56
тин, клупеин и др.). Реактив Миллона дает окрашивание почти со всеми фенолами.
К раствору белка объемом 1–2 мл прилить 5–6 капель реактива
Миллона. Осадок белка при нагревании окрашивается в краснокоричневый цвет вследствие образования ртутной соли нитрозина.
Следует избегать прибавления избытка реактива Миллона, поскольку
он содержит азотную кислоту, которая при взаимодействии с белком
может дать желтое окрашивание (ксантопротеиновую реакцию), маскирующее реакцию Миллона.
NH
2
CHC
CH
2
HO
O
OH
+HNO3 + HgNO
3
NH
2
CHC
H2C
HO
O
NO
2
O
N
OHg
O
+ 2H2O
тирозин
ртутная соль динитротирозина
(красно-коричнегого цвета)
4. Реакция Адамкевича
Эта реакция обусловлена присутствием в молекуле белка триптофана и его взаимодействием с глиоксиловой кислотой. Если к раствору белка добавить незначительное количество глиоксиловой кисло-
ты
H
C
H
C
OO
и концентрированной серной кислоты, развивается
красно-фиолетовое окрашивание. Реакция обусловлена конденсацией
триптофана с альдегидами с образованием окрашенных продуктов.
В качестве источника глиоксиловой кислоты может служить ле-
дяная уксусная кислота, в которой всегда имеются небольшие количества глиоксиловой кислоты:
N
H
NH
2
CH
COOH
H
2
C
HCH
C
OO+
триптофан
глиоксиловая кислота
57
К раствору белка объемом 1 мл прилить 1 мл концентрирован-
ной уксусной кислоты. Осторожно, сильно наклонив пробирку, по
стенке прибавить 1 мл концентрированной серной кислоты так, чтобы
жидкости не смешивались. На границе между ними появляется красно-фиолетовое кольцо.
5. Реакция на серу в белках (реакция Фоля)
Реакцию Фоля дают белки, содержащие цистин и цистеин. Если
к раствору белка добавить щелочь, уксуснокислый свинец и прокипятить, развивается темное окрашивание. При кипячении белка со щелочью слабосвязанная сера указанных аминокислот отщепляется и образуется сульфид натрия, который вступает во взаимодействие с уксуснокислым свинцом с образованием сульфида свинца черного цвета.
Реакция протекает следующим образом:
H2C
HC
SH
NH
2
COOH
+ 2 NaOH
H2C
HC
OH
NH
2
COOH
+Na2S +H2O
.
цистеин
серин
Уксуснокислый свинец реагирует со щелочью с образованием
плюмбита натрия:
(CH3COO)2Pb + 2 NaOH
Pb(ONa)2 + 2 CH3COOH
.
N
H
NH
2
CH
COOH
H2C
N
H
NH
2
CH
COOH
CH
2
CH
COOH
+ H2O
Продукты конденсации триптофана с глиоксиловой кислотой
(красно-фиолетового цвета)
Сульфид натрия при взаимодействии с плюмбитом образует
Na2S +
Pb(ONa)2 +2 H2O PbS + 4 NaOH
черный осадок
58
осадок сульфида свинца черного цвета:
К раствору белка объемом 1 мл прилить 2–3 мл 10 % гидроксида
натрия и вскипятить. В горячий раствор добавить небольшое количество уксуснокислого свинца. Раствор темнеет, образуя черный осадок
сульфида свинца.
Метионин, как известно, хотя и содержит серу, но этой реакции
не дает (сера прочно удерживается метильной группой).
59
Л а б о р а т о р н а я р а б о т а 2
О П Р Е Д Е Л Е Н И Е И З О Э Л Е К Т Р И Ч Е С К О Й Т О Ч К И Б Е Л К А
Цель работы: изучение физико-химических свойств белков и
определение изоэлектрической точки белка методом светорассеяния.
Материалы и реактивы: 0,1 % раствора казеина, уксусная
кислота (0,2 М), ацетат натрия (0,2 М), этиловый спирт, дистиллированная вода.
Оборудование: рН-метр, штатив с пробирками, пипетки.
Контрольные вопросы: белки как полиамфолиты; ионизаци-
онное состояние белков в растворе; изоэлектрическая точка полиамфолита и методы ее определения; зависимость физико-химических
свойств белков от рH среды.
Теоретическое введение
Два наиболее важных класса биополимеров – белки и нуклеиновые кислоты – относятся к природным полиамфолитам. Полиамфолиты – это сополимеры, содержащие звенья как с кислотными, так и
с основными группами. Вследствие наличия способных к ионизации
групп (концевых групп -СООН и -NH2), а также боковых групп дикарбоновых и диаминокислот молекулы белков обладают электрическим
зарядом – положительным и отрицательным. В кислой среде белки
имеют суммарный положительный заряд:
R-NH2 + H
+
RNH
3
+
;
в щелочной среде – отрицательный:
R-COOH+OH
-
R-COO-+H2O
.
При определенном значении рН среды величина положительных и отрицательных зарядов становится одинаковой и суммарный
заряд белка оказывается равным нулю (изоэлектрическое состояние
белка). Значение рН, при котором белок находится в изоэлектрическом состоянии, называется изоэлектрической точкой белка (ИЭТ).
Определяют ИЭТ с помощью электрокинетических методов (электро-
60
форез) или по изменению физико-химических свойств растворов, зависимости которых от pH характеризуются наличием минимума в
ИЭТ (вязкость, мутность, электропроводимость). Например, удельная
вязкость (ηуд) минимальна в ИЭТ, так как макромолекула белка принимает свернутую конформацию (рис. 1, кривая 1). При удалении от
ИЭТ макромолекула полиамфолита белка приобретает заряд и стремится к разворачиванию. Увеличение ионной силы раствора (кривая
4) приводит к подавлению диссоциации ионогенных групп и сворачиванию макромолекул вдали от ИЭТ, и, напротив, к увеличению разворачивания вблизи ИЭТ.
Рис. 1. Зависимость физико-химических свойств растворов белков
от рН среды: 1 – приведенная вязкость
с
уд
; 2 – удельная
электропроводность
; 3 – мутность ; 4 –
с
уд
в присутствии солей
Заряженностъ молекулы белка является одним из основных
факторов его устойчивости в растворах, так как мешает слипанию
белковых частиц и выпадению их в осадок. В ИЭТ растворы белков
неустойчивы и белки легко выпадают в осадок, особенно в присутствии водоотнимающих веществ (этиловый спирт, ацетон и др.)
Методика выполнения лабораторной работы основана на способности растворенного белка (казеина) в ИЭТ переходить в неустойчивое состояние и выпадать в осадок, что проявляется в выраженном
помутнении раствора. При добавлении этилового спирта (водоотнимающего средства) процесс осаждения белка ускоряется. Соответственно, ИЭТ белка можно определить, измеряя светопропускание
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]