Добавил:
Sekretar
kiopkiopkiop18@yandex.ru
t.me/Prokururor I Вовсе не секретарь, но почту проверяю
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ординатура / Хирургия / Библиотека им академика М.И. Перельмана / Книга_2789_Библиотеки_им_академика_М_И_Перельмана
.pdf
Часть III. О самом проблемном
https://t.me/medicina_free
с компьютерной обработкой изображения, просвечивающую
и сканирующую электронную микроскопию [Kinner N.E. et al.,
1983; Robinson R.W. et al., 1984; Costerton J.W. et al., 1987;
Lawrence J.R. et al., 1987]. Для исследований и характеристики биопленок на внедряемых медицинских устройствах, в том
числе при инфекции эндокарда, преимущественно использовалась электронная микроскопия [Ferguson D.J.P. et al., 1986;
Costerton R.I.W. et al., 1993]. Однако использование этих методов приводило к обманчиво упрощенному представлению о биопленках, так как для электронной микроскопии требуется полное
обезвоживание высокогидратированного матрикса биопленки,
а при световой микроскопии возникают эффекты фокального
искажения. Поэтому первоначально биопленки воспринимались
и описывались как неструктурированные разрастания бактериальных клеток, окруженные экзополисахаридным матриксом.
Применение конфокальной сканирующей лазерной микроскопии для исследования биопленок радикально изменило восприятие их структурных и функциональных особенностей. Этот
метод дал возможность исследовать биопленки in situ без ограничений, с которыми сталкивается электронная микроскопия,
хотя и при более низких увеличениях. С помощью конфокальной
сканирующей лазерной микроскопии показано, что биопленки —
неструктурно гомогенные монослои микробных клеток на поверхности. Скорее, они могут быть описаны как гетерогенные
во времени и пространстве структуры, но основная структура сообщества универсальна, с некоторыми незначительными вариациями [Donlan R.M., William J., 2002]. У большинства биопленок
можно наблюдать некоторый уровень структурной разнородности, когда совокупность клеток, вкрапленных в экзополисахаридный матрикс, изменяется по плотности, создавая открытые
области, где сформированы водные каналы.
Этот матрикс состоит из смеси полисахаридов, выделяемых
в окружающую среду (экзополисахариды), белков, нуклеиновых
кислот и других веществ. Бактериальные экзополисахариды —
главный компонент матрикса биопленки, который некоторые
авторы называют также гликокаликсом или слизистым чехлом.
Основной его компонент — связанная вода. Все биопленки высокогидратированы, некоторые до 73% состоят из внеклеточ-
320
Глава 24. Микробные биопленки
https://t.me/medicina_free
ного материала, включая водные каналы и экзополисахариды.
У большинства видов экзополисахаридный матрикс состоит из
альгината, будучи преобладающе анионным. Матрикс является
трехмерной структурой, которая окружает, закрепляет и защищает прикрепленные к различным поверхностям микроколонии
бактерий.
Поры и каналы, пронизывающие всю биопленку, — очень
важная часть ее структуры. Образно их можно сравнить с кровеносной системой ткани биопленки. При использовании гранулометрических методов было доказано движение потока жидкости
через эти каналы [Stoodley P. et al., 1994]. Каналы позволяют
свободно распространяться по всей толщине биопленки низкомолекулярным веществам, таким как, например, флуоресцеин,
из чего следует, что эти вещества примерно одинаково доступны
всем клеткам биопленки. Таким образом, каналы — жизненно
важный элемент структуры биопленки, непосредственно влияющий на ее функции, тем не менее механизмы их формирования
и поддержания еще не вполне ясны. Каналы обеспечивают распространение питательных веществ и обмен продуктами метаболизма с окружающей жидкостью [Costerton J.W. et al., 1995].
Например, измерение in situ растворенного кислорода с использованием микроэлектродов показало, что кислород, как и субстраты, доступен в любой точке биопленки, из чего следует, что
каналы транспортируют окисленную жидкость по всей толщине
биопленки [Costerton J.W. et al., 1995]. При этом важно отметить,
что биопленки непроницаемы для достаточно крупных молекул
большинства антибиотиков, так как пропускают лишь вещества
с низким молекулярным весом.
Интересно, что биопленки, сформированные одним видом
in vitro, при сравнении с ассоциациями, образованными в естественных экосистемах (так называемый смешанный консорциум
видов), демонстрируют общие для всех структурные особенности [Costerton J.W. et al., 1995]. На структуру биопленки влияют
многочисленные внешние условия, например свойства поверхности, количество доступных питательных веществ, видовой состав микробного сообщества, а также гидродинамические условия окружающей среды [Costerton J.W. et al., 1995]. Понимание
структурных особенностей биопленок и условий, при которых
321
Часть III. О самом проблемном
https://t.me/medicina_free
отдельные микроколонии начинают отделяться от материнской
биопленки, необходимо при изучении таких бактериальных
инфекций, как, например, инфекционный эндокардит. Отрыв
микроколоний с устойчивым к антибиотикам фенотипом биопленки представляет серьезный риск инфекционной эмболии
в любом капилляре, последствия чего хорошо известны клиницистам [Donlan R.M., William J., 2002].
Данные, полученные нами на начальных этапах поиска в этой
области, касаются исследования способности к формированию
биопленок у эпидермальных стафилококков как наиболее часто
выделяемых при инфекционном эндокардите микроорганизмов.
Изучались штаммы Staphylococus epidermidis, выделенные нами
из интраоперационного материала (резецированная ткань пораженных клапанов) у пациентов, оперированных в НЦ ССХ
им. А.Н. Бакулева по поводу активного инфекционного эндокардита. Все изученные штаммы in vitro демонстрировали высокую
способность к формированию биопленок.
24.3. МЕХАНИЗМЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ БИОПЛЕНОК
Экологические преимущества биопленок. Логично предположить, что рост в сообществе экологически более выгоден
микроорганизмам, чем жизнь в виде отдельной клетки. Изучение
и понимание фундаментальных экологических механизмов
функционирования биопленок позволит разработать новые стратегии управления или борьбы с ними.
Экологические преимущества существования микроорганизмов в виде биопленки состоят прежде всего в следующем.
1. Облегчение доступа питательных веществ и метаболиче-
ская кооперация.
Как было описано выше, вся биопленка пронизана системой
каналов, окружающей микроколонии и эффективно обеспечивающей обмен питательных веществ и метаболитов с окружающей
жидкостью, улучшая доступ питательных веществ и удаляя потенциально токсичные метаболиты [Costerton J.W. et al., 1995].
2. Защита от негативных воздействий окружающей среды.
При росте в виде биопленки, состоящий из экзополимерных веществ, бактерии получают некоторую степень защиты
322
Глава 24. Микробные биопленки
https://t.me/medicina_free
от экологических угроз, включая биоциды, антибиотики, антитела, поверхностно-активные вещества, бактериофаги, фагоциты
[Costerton J.W. et al., 1995; Costerton J.W. et al., 1987], ультрафиолетовое излучение, изменение pH, высушивание, а также получают возможность сохранения постоянства условий существования (гомеостаза), в том числе путем связывания катионов или
токсинов [Flemming H.-C., 1993]. Отдельными исследованиями
показано, что экзополисахаридный матрикс физически предотвращает доступ некоторых антибактериальных агентов в биопленку, действуя как ионообменник, ограничивая таким образом
распространение нежелательных веществ из окружающей среды
в биопленку [Gilbert P. et al., 1997].
3. Резистентность к антибактериальным агентам.
На пути прогресса антибиотикотерапии инфекционных болезней существует несколько серьезных препятствий, одно из
которых (наряду с генетической и приобретенной устойчивостью бактерий к антибиотикам) связано с бактериями, находящимися в биопленке. Концентрации антибиотиков, требуемых
для достижения бактерицидного эффекта для микроорганизмов, структурированных в биопленку, иногда в зависимости
от природы антибиотика может быть в 10–100 раз выше, чем
для планктонных форм данной бактерии [Gilbert P. et al., 1997].
Стандартное лечение антибиотиками могут уничтожить только
планктонные клетки, не затрагивая прикрепленные формы, которые способны выживать в биопленке и размножаться, когда
терапия закончена. Кроме того, патогены, живущие в биопленке, взаимодействуют с иммунной системой хозяина. Антигены
бактерий биопленки стимулируют синтез антител, но при этом
устойчивы к механизмам защиты хозяина [Costerton J.W. et al.,
1999]. В результате этот иммунный ответ может повреждать
окружающие ткани [Davey M.E., O’Toole G.A., 2000], как, например, при артобстреле повреждаются стенки неприступного
сооружения.
Резистентность — это способность микроорганизма расти
в присутствии высоких концентраций антибактериального препарата. Чаще всего клетки биопленки, взятые отдельно от экзополисахаридного матрикса, не более устойчивы, чем планктонные по отношению к широкому диапазону антибактериальных
323
Часть III. О самом проблемном
https://t.me/medicina_free
препаратов [Lewis K., 2000]. Однако в большинстве исследований зарегистрировано выживание клеток в предварительно
сформированной биопленке. Более того, возможно, биопленка
даже способна расти в их присутствии. Действительно, биопленки очень трудно поддаются уничтожению антибактериальными
препаратами. Способность антибактериальных препаратов подавлять рост биопленки означает, что они могут распространяться
через биопленку и активны в отношении своих мишеней, правда,
при этом клетки в ней не погибают [Lewis K., 2000].
В научной литературе активно изучается этот важный для
клинического применения феномен [Costerton J.W. et al., 1999;
Gilbert P. et al., 1997; Maira-Litran T. et al., 2000]. К настоящему
моменту описан ряд факторов, ответственных за резистентность
биопленок к антибиотикам. К ним относятся:
• инактивация антибиотиков внеклеточными полимерами
или ферментами;
• замедление метаболизма и соответственно уменьшение
скорости роста микроорганизмов в условиях лимитирования питательных веществ в биопленке, из-за чего антибактериальный препарат диффундирует из биопленки
быстрее, чем успеет на них подействовать;
• экспрессия возможных генов резистентности;
• возникновение в биопленке под воздействием антибио-
тиков микроорганизмов-персистентов.
Ниже каждый из этих механизмов рассмотрен более подробно.
Пока далеко не все механизмы резистентности биопленок
к антибиотикам ясны, но для клиницистов огромное практическое значение имеет следующее обобщение: если планктонные
клетки микроорганизма выделены из крови и они чувствительны
к тем или иным препаратам, это вовсе не означает, что этот же
микроорганизм, находящийся в очаге воспаления в составе биопленки, будет полностью элиминирован при проведении антибиотикотерапии (рис. 8).
Антибиотики и факторы иммунитета более эффективно действуют на планктонные формы микроорганизмов. Часть микробных клеток, заключенных в матрикс, остаются недоступными
для фагоцитов, эти микробы выживают и после отмены анти-
324
Глава 24. Микробные биопленки
https://t.me/medicina_free
Антибиотики
Рис. 8. Схема возможных факторов резистентности микроорганизмов биопленок к различным антимикробным факторам (по Н.В. Белобородовой, И.Т. Бай-
Факторы
иммунитета
рамову, 2008)
Факторы
иммунитета
бактериальной терапии могут снова размножаться и вызывать
рецидив заболевания.
В качестве примера приводим наши неопубликованные данные,
где изучался S. epidermidis, выделенный из тканей пораженного
инфекционным эндокардитом трехстворчатого клапана сердца,
чувствительный к ванкомицину. Показано, что микроорганизмы
биопленки, образованной in vitro этим клиническим изолятом,
не только не погибали при концентрации ванкомицина 5 мг/мл
в течение 24-часовой инкубации, но и численность их уменьшалась весьма незначительно (с 3 × 10
9
до 5 × 106 КОЕ/мл). При
посеве выживших после воздействия антибиотика микроорганизмов на агар они вновь демонстрировали чувствительность
к обычным терапевтическим концентрациям ванкомицина.
Эти данные коррелируют с другим исследованием
[Dunne W.M., Burd E.M., 1993], где показано, что 15-кратная
МПК тобрамицина и 20-кратная МПК имипнема в 100 тыс. раз
уменьшают количество жизнеспособных взвешенных клеток
S. epidermidis после 6 ч экспозиции, но не более чем в 1 тыс. раз
уменьшают количество жизнеспособных бактерий в биопленке
даже после 10 ч инкубации. Кроме того, комбинация тобрамицина и импинема демонстрировала синергический эффект против
взвешенных микроорганизмов, но этот эффект не наблюдался
в отношении бактерий, защищенных альгинатами.
Инактивация антибиотиков биопленкой. Экзополимерный
матрикс биопленки может ограничивать диффузию веществ
325
Часть III. О самом проблемном
https://t.me/medicina_free
и связывать антимикробные препараты. Внеклеточные полимерные вещества, составляющие матрикс, представляют собой диффузионный барьер для молекул антимикробных веществ. Это
обеспечивает резистентность клеток биопленки к крупным белковым молекулам типа лизоцима и комплемента, а также к крупным антимикробным пептидам и другим агентам [Lewis K., 2001].
Интересный пример барьерной функции экзополисахаридов
был описан для пероксида водорода. В отличие от планктонных
клеток, которые весьма чувствительны к H
и гибнут при его
2O2
концентрации 50 мкM, бактерии в биопленке были эффективно
защищены, так как доза, доходящая до клеток биопленки, фактически была ниже уровня каталазной активности [Elkins J.G.
et al., 1999; Hassett D.J. et al., 1999].
Показано, что отрицательно заряженные экзополисахариды весьма эффективно защищают клетки биопленки от гидрофильных и положительно заряженных антибиотиков, например аминогликозидов [Nichols W.W. et al., 1989; Ishida H. et al.,
1998]. В другой работе с аминогликозидами [Hoyle B.D. et al.,
1992] было показано, что рассеянные бактериальные клетки
были в 15 раз более восприимчивы к тобрамицину, чем клетки
в биопленках. Исследования внеклеточного полимерного вещества биопленок [Hatch R.A., Schiller N.L., 1998] продемонстрировали, что 2% суспензия альгинатов, выделенная из биопленки
P. aeruginosa, ингибировала распространение гентамицина и тобрамицина, однако этот эффект отсутствовал при одновременном использовании альгинатных лиаз.
В других исследованиях изучалось проникновение других антибиотиков (цефтазидим, пиперациллин, гентамицин, тобрамицин) через синтетические и природные альгинатные гели. Было
показано, что E-лактамные антибиотики распространялись по
матриксу более быстро, чем аминогликозиды. Аминогликозиды
первоначально связывались альгинатами, но затем их диффузия увеличилась после 80–100-минутного периода задержки
[Gordon C.A. et al., 1988].
Чрезвычайно важны исследования, касающиеся гликопептидов, так как ванкомицин является базовым препаратом для
лечения инфекционного эндокардита в кардиохирургии. В одной
из работ показана способность экзополисахаридов S. epidermidis
326
Глава 24. Микробные биопленки
https://t.me/medicina_free
препятствовать восприимчивости В. subtilis к ванкомицину
[Souli M., Giamarellou H., 1998], но данный эффект не был показан в отношении рифампицина, клиндамицина, макролидов.
В другой работе [Farber B.F. et al., 1990] показано, что полисахариды слизи S. epidermidis снижали антибактериальную активность гликопептидных антибиотиков. Добавление экстракта этих
полисахаридов в количестве 0,5% к бульону увеличило МПК
ванкомицина и тейхопланина в 5 раз. Полисахариды, образующие матрикс S. epidermidis, также блокировали синергидный
эффект ванкомицина и гентамицина, но никак не влияли на активность клиндамицина, рифампицина и цефазолина, поэтому
авторы предположили, что полисахариды матрикса физически
инактивируют гликопептиды, либо создавая с ними комплексы, либо другим путем препятствуя их диффузии к микробной
клетке. Однако в другом эксперименте in vitro [Dunne W.M. et al.,
1993] биопленка S. epidermidis не предотвращала диффузии ванкомицина или рифампицина, вместе с тем микроорганизмы
в биопленке также не погибали при концентрациях антибиотиков, превышающих их бактерицидные количества.
Можно обобщить, что при использовании антибактериальных препаратов с небольшим размером молекул барьер полисахаридного матрикса может лишь отсрочить гибель клеток, но не
предоставляет бактериям полную защиту. Например, фторхинолоны легко диффундируют сквозь биопленку и весьма эффективно
останавливают ее рост [Brooun A. et al., 2000]. В то же время описаны биопленки, образованные Pseudomonas aeruginosa, которые
в эксперименте способны замедлять проникновение ципрофлоксацина: если для поверхности, не покрытой биопленкой Pseudomonas
aeruginosa, этот процесс занимал 40 с, то для поверхности, покрытой такой биопленкой, требовалось 21 мин [Suci P.A. et al., 1994].
Отсроченное проникновение уменьшает концентрацию антибиотика, входящего в биопленку, помогая бактериальным ферментам
инактивировать поступающий антибиотик. В математической модели, основанной на экспериментальных наблюдениях, анализу
подвергаются синергические отношения между отсрочкой проникновения и деградацией [Stewart P.S., 1996].
Замедление роста биопленки. В литературе дискутируется
другой механизм резистентности микроорганизмов биопленки
327
Часть III. О самом проблемном
https://t.me/medicina_free
к антибактериальным препаратам, связанный с тем, что клетки
в биопленке растут значительно медленнее, чем планктонные,
и в результате медленнее усваивают антибактериальный препарат. Было показано, что скорость роста биопленки S. epidermidis
влияла на его восприимчивость: чем быстрее скорость метаболизма, а следовательно, и роста клетки, тем быстрее наступает
ее инактивация ципрофлоксацином [DuGuid I.G. et al., 1990].
Медленный рост — важный фактор увеличения устойчивости
планктонных клеток в стационарной фазе роста, следовательно,
он несомненно вносит «вклад» и в резистентность микроорганизмов биопленки к антибактериальным препаратам [Costerton J.W.
et al., 1999]. Также H. Anwar и соавт. (1992) показано, что старые (10-дневные) биопленки P. aeruginosa были значительно
более устойчивы к тобрамицину и пиперациллину, чем молодые
(2-дневные). Дозировка 500 мкг пиперациллина плюс 5 мкг тобрамицина в 1 мл полностью инактивировала и планктонные,
и молодые (2-дневные) клетки биопленки, тогда как количество
старых (10-дневных) клеток биопленки после применения этой
дозы уменьшилось только на 20%.
Подобные результаты получены в исследованиях с различными комбинациями бактерий и разными антибактериальными препаратами [Chuard C. et al., 1993; Amorena B. et al., 1999].
Фактически все антибактериальные препараты более эффективны в отношении быстрорастущих клеток. Пенициллин и ампициллин не уничтожали нерастущие клетки вообще. Современные
E-лактамы, аминогликозиды и фторхинолоны могут действовать
и на нерастущие клетки, но они тоже явно более эффективны
в отношении быстроделящихся клеток.
Получены данные в пользу того, что уменьшение метаболической активности и соответственно скорости роста и деления влияет на восприимчивость микроорганизмов к действию
антибактериальных агентов [Eng R.H.K. et al., 1991]. Управляя
скоростью роста бактерий путем ограничения доступа питательных веществ, авторы показали, что на находящиеся в стационарной фазе роста грамотрицательные микроорганизмы действуют
только фторхинолоны. Увеличение концентрации питательных
веществ, способствующее росту микроорганизмов, многократно увеличивало и бактерицидный эффект антибиотиков. Более
328
Глава 24. Микробные биопленки
https://t.me/medicina_free
того, бактерицидная активность антибиотиков была намного
выше в отношении молодых (4-дневных биопленок), нежели чем
в отношении старых (13-дневных).
Можно предположить, что многие микроэкологические фак-
торы (например, pH, pCO
, pO2, концентрация двухвалентных
2
катионов, уровень гидратации, концентрация пиримидинов)
в самых глубоких слоях бактериальной биопленки, где сохраняются кислые и анаэробные условия, неблагоприятные для антибактериальной активности in vitro, будут влиять на активность
антибиотиков и in situ. Заранее можно предсказать, что актив-
ность аминогликозидов, макролидов и тетрациклинов будет,
вероятно, весьма низкой в кислой среде с увеличенным pCO
2
Кроме того, полианионные альгинаты по самой своей природе имеют тенденцию концентрировать двухвалентные катионы,
что будет отрицательно влиять на активность аминогликозидов
и тетрациклинов [Jorgensen J.H. et al., 1999] и т.д. Таким образом,
разные механизмы комплексно участвуют в развитии резистентности микроорганизмов в биопленках к действию антибиотиков.
Экспрессия возможных генов резистентности. Как уже
было сказано, выделенные в чистой культуре клетки биопленки
не более стойки к антибиотикам, чем планктонные клетки, поэтому нет необходимости искать у клеток с фенотипом биопленки
некие специальные механизмы резистентности.
Более интересный вопрос, экспрессируют ли биопленки какие-либо определенные гены, позволяющие им более эффективно выживать при неблагоприятных условиях [Lewis K., 2001]?
Высказано предположение, что начальная бактериальная адгезия
на поверхность может завершиться индукцией или, напротив,
репрессией генов, которые, в свою очередь, результируются во
множестве физиологических ответов [Dagostino L. et al., 1991].
Исследования экспрессии возможных генов резистентности начаты относительно недавно и, возможно, будут полезными для
понимания генетических механизмов резистентности микроорганизмов биопленок к антибиотикам.
Возникновение в биопленке микроорганизмов-персистентов. Приведенные и проанализированные выше факторы не объ-
ясняют резистентность биопленок к бактерицидному действию,
по крайней мере, одной важной группы антибактериальных
.
329
Соседние файлы в папке Библиотека им академика М.И. Перельмана