Добавил:
Sekretar
kiopkiopkiop18@yandex.ru
t.me/Prokururor I Вовсе не секретарь, но почту проверяю
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ординатура / Хирургия / Библиотека им академика М.И. Перельмана / Книга_931_Библиотеки_им_академика_М_И_Перельмана
.pdf
290 Часть V. Тканевая инженерия и регенеративная медицина, биоискусственные органы
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Биополимерные материалы или их
композиции, содержащие биологически
активные вещества, по сравнению с био:
деградируемыми синтетическими полиме:
рами в наибольшей степени удовлетворяют
основным требованиям, предъявляемым к
матриксам для клеточно: и тканеинженер:
ных конструкций, таким как:
— биосовместимость изделия и продуктов
его деструкции;
— наличие био стимулирующих свойств;
— возможность регулировать время биоде:
градации;
— способность к неоваскуляризации и нео:
иннервации;
— выполнение функции каркаса и пита:
тельной среды для клеточных компо:
нентов тканеинженерных конструкций;
— адгезивность к клеточным культурам и
способность стимулировать их проли:
ферацию;
— возможность стерилизации без измене:
ния медико:технических свойств конеч:
ного продукта.
При разработке матриксов немаловаж:
ное значение имеет размер пор и общая
пористость матрикса для обеспечения мас:
сопереноса как продуктов питания, так и
продуктов метаболизма клеток, а также
необходимых условий для неоваскуляри:
зации и неоиннервации тканеинженерной
конструкции. По имеющимся данным,
наиболее оптимальной является величина
пористости не менее 95% с размером сооб:
щающихся пор от 50 до 150 мкм.
Однако при разработ ке матриксов из
биополимерных материалов необходимо
найти пути устранения таких недостатков,
как высокая стоимость получения био:
полимеров, неудовлетворительная вос:
производимость их свойств, сложно сть
обработки, плохая механическая проч:
ность и для некоторых из них, например
в случае коллагена, быстрое время биоде:
градации.
Высокая потенциальная роль биопо:
лимеров в биомедицинских технологиях
нашла отражение при описании сценария
коммерциализации в США технологий
регенеративной медицины в области тка:
невой инженерии и регенерации органов
с 2000 по 2060 г., состоящей из следующих
этапов:
2000 г. — коммерциализация результа:
тов исследований в области тканевой ин:
женерии.
2015 г. — полное замещение синтетиче:
ских биодеградируемых матриксов на ма:
триксы из биологических полимеров.
2025 г. — разработка промышленных
технологий (масштабирование техноло:
гий) для культивирования аутологичных
клеток и технологий тканевой инженерии
на их основе.
2050 г. — разработка технологий конвер:
тации аллогенного генотипа в аутологич:
ный генотип.
2060 г. — создание коммерческих банков
для создания и хранения биоискусствен:
ных органов («запасных частей») для кон:
кретного реципиента.
Если достаточную механическую проч:
ность и пористую структуру матриксов для
создания биоинженерных конструкций
можно легко обеспечить за счет подбора
конструкционного материала и технологии
его переработки, то проблему биоимитиро:
вания биологических и функциональных
свойств каркаса ТИК решить значительно
сложнее. Несмотря на то что существующие
к настоящему времени матриксы обладают
достаточно высокой биосовместимостью,
плотность мест связывания клеток на их по:
верхности невелика, а микроокружение ад:
гезированных клеток не обеспечивает ком:
фортных условий для их роста, пролифе:
рации и дифференцировки in vitro в случае
иммобилизованных стволовых клеток.
Одним из важных свойств, которым дол:
жен обладать матрикс, является его способ:
Глава 12. Тканеинженерные конструкции (биомедицинские клеточные продукты) 291
ность поддерживать адгезию и пролифера3
цию различных клеток органов и тканей.
Многие материалы, включая синтетиче3
ские полимеры, биокерамику, металлы, та3
кими свойствами не обладают вследствие
отсутствия взаимодействия с клетками по
принципу лиганд–рецептор.
Для придания поверхности матрикса
свойств, способствующих специфическому
взаимодействию с культивируемыми клет3
ками, применяют различные методы моди3
фицирования. Наибольшее распростране3
ние получила ковалентная иммобилизация
биологически активных веществ (БАВ), в
основном поли3 и олигосахаридов, пепти3
дов и белков, ответственных за адгезивные
свойства, таких как RGD3пептид (Arg3Gly3
Asp) и соединения на его основе. Поми3
мо адгезионных пептидов на поверхности
2D3 и 3D3матриксов нередко иммобилизу3
ют разнообразные факторы роста, а также
сигнальные молекулы, способствующие
дифференциации клеток. Тем не менее
подходы к оптимизации взаимодействия
матриксов с клетками за счет прочной (ко3
валентной) фиксации на их поверхности
БАВ не лишены серьезных недостатков.
Основным из них следует признать частич3
ную или полную потерю иммобилизован3
ными агентами своей активности в резуль3
тате фиксации в непосредственной близо3
сти от поверхности. Так, адсорбированный
интерлейкин31 стимулирует дифференци3
ацию моноцитов, в то время как ковалент3
но3иммобилизованный интерлейкин31 эту
способность утрачивает. В основе другого
способа формирования на поверхности
3D3матриксов биоактивных покрытий ле3
жит нековалентное взаимодействие между
биоактивной молекулой и подложкой. Ос3
новным недостатком таких покрытий яв3
ляется их низкая устойчивость в условиях
контакта с биологическими средами. Для
улучшения их адгезионной стабильности
применяют обработку сшивающими аген3
тами, что нередко отрицательно сказыва3
ется на биологической активности покры3
тий. Кроме того, покрытия, основанные
на адсорбции или ионном связывании с
поверхностью матрикса, нельзя нагрузить
БАВ в концентрации, обеспечивающей до3
статочное их функционирование.
Наиболее биологическим способом
создания тканеспецифических матриксов
является их получение путем децеллюля3
ризации нативных тканей или цельных
органов. Основным преимуществом ТИК
с децеллюляризированными матриксами
является сходство их структуры с соответ3
ствующими 3D3структурами и внутренней
Рис. 12.1. Тканеспецифические матриксы печени. А — децеллюляризо3
ванная печень. Б — мелкодисперсная децеллюляризованная ткань печени
А Б
292 Часть V. Тканевая инженерия и регенеративная медицина, биоискусственные органы
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
архитектоникой нативных внеклеточных
матриксов кровеносных сосудов, печени,
сердца и др.
Недостатками децеллюляризированных
матриксов являются проблема отмывки де:
тергентов, используемых в процессе деви:
тализации тканей, а также трудности обе:
12.3. Биомолекулы
В человеческом организме синтезируется це:
лый ряд биомолекул, таких как цитокины,
факторы роста, антиоксиданты, компонен:
ты внеклеточного матрикса и т. д. Цитокины
и факторы роста — сигнальные молекулы,
управляющие пролиферацией, дифферен:
цировкой, миграцией и адгезией клеток —
широко используются в тканевой инженерии
и регенеративной медицине для стимуляции
поврежденных клеток или воздействия на
клеточную составляющую ТИК.
Цитокины являются низкомолекуляр:
ными (менее 30 kDa) белковыми клеточ:
ными регуляторами, участвующими в про:
цессах межклеточной коммуникации, рас:
сматриваются как медиаторы нормальных
биологических процессов, таких как рост
и дифференцировка гемопоэтических,
лимфоидных и мезенхимальных клеток,
иммунные реакции и воспаление. К ци:
токинам относятся колониестимулирую:
щие факторы, некоторые факторы роста,
интерлейкины и интерфероны. Факторы
роста (growth factors, GF) — белковые мо:
лекулы, регулирующие пролиферацию,
дифференцировку и подвижность клеток
высших организмов, часто индуцируют
синтез ДНК, влияют на экспрессию генов.
спечения жизнеспособности заселяемых в
пористый каркас клеток. Одним из предла:
гаемых решений для создания, например,
ТИК печени может быть использование
тканеспецифического мелкодисперсного
матрикса, полученного из децеллюляризи:
рованной печени (рис. 12.1) .
К факторам роста, используемым при соз:
дании ТИК, относятся инсулиноподобный
фактор роста (IGF), факторы роста фибро:
бластов (FGF), тромбоцитарный фактор
роста (PDGF), эпидермальный фактор ро:
ста (EGF) и др.
Так, например, при изготовлении ТИК
кровеносного сосуда в матрикс целесо:
образно вводить такие факторы роста, как
сосудистый эндотелиальный фактор роста
(VEGF), основной фактор роста фибро:
бластов (bFGF) и хемокин — стромальный
фактор (SDF:1). Ростовые факторы VEGF
и bFGF крайне важны для активации ми:
грации и пролиферации эндотелиальных
клеток, а также для стимуляции и регуляции
ангиогенеза, а фактор SDF:1b осуществляет
активацию и направленную миграцию ге:
мопоэтических и мезенхимальных стволо:
вых клеток в места повреждения, тем самым
способствуя регенерации тканей.
Для защиты мембраны клеточных ком:
понентов ТИК целесообразно в матрикс
вводить антиоксиданты природного про:
исхождения, такие как :токоферол (ви:
тамин Е), кислоту аскорбиновую (вита:
мин С), ретинол (витамин А), :каротин
(провитамин А), дигидрокверцетин.
Глава 13
ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ
ТРЕХМЕРНЫХ МАТРИКСОВ ДЛЯ КЛЕТОЧНО4
И ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ
Наибольший интерес для ТИК представ6
ляют трехмерные матриксы из биодегради6
руемых биологических или синтетических
полимеров, для изготовления которых ис6
пользуется ряд технологий:
— нетканое связывание полимерных нитей;
— ультрадиспергирование с последующей
сшивкой;
— выщелачивание;
— гель6сублимация;
— электроспиннинг;
— 3D6принтирование;
— сверхкритическая флюидная пластифи6
кация полимеров и их вспенивание;
— лазерное биопринтирование;
— многофотонная лазерная полимеризация;
— лазерная стереолитография;
— поверхностно6селективное лазерное
спекание (ПСЛС);
— фотохимическое микро6 и нанострукту6
рирование.
Технологии электроспиннинга, 3D6био6
принтирования, все виды лазерных тех6
нологий и поверхностно6селективное ла6
зерное спекание относятся к аддитивным
технологиям, то есть к технологиям послой6
ного формирования физического объекта, в
данном случае матрикса.
Кратко рассмотрим наиболее часто ис6
пользуемые технологии при разработке
биоискусственных систем.
Данный метод создания матриксов предпо6
лагает использование растворимого в воде
порообразователя, например поваренной
соли. Полимер растворяют в хлороформе или
в хлористом метилене. Полученным раство6
ром заливают порообразующую соль. После
испарения растворителя соль вымывают из
раствора водой. Пористость получаемого
матрикса (рис.13.1) можно до некоторой сте6
пени контролировать, изменяя количество
порообразователя, размер пор определяется
размером кристаллов соли. Такие матрик6
сы проявляют высокую биосовместимость к
различным клеткам. Метод выщелачивания
также применим при работе с органи ч е ск и 6
ми растворителями, что дает возможность
добавления факторов роста или питательных
веществ на этапе приготовления матрикса.
13.1. Метод выщелачивания
Рис. 13.1. Микр офотографи я получе нного ме 6
тодом выщелачивания 3D6матрикса, который
изготовлен из нанокомпозиционного матери6
ала на основе биосинтеза высокоочищенного
сополимера поли(оксибутиратоксивалерата)
и полиэтиленгликоля. Сканирующая элек6
тронная микроскопия. Пористость не менее
95 ± 2%, размер микропор 300 ± 100 мкм
294 Часть V. Тканевая инженерия и регенеративная медицина, биоискусственные органы
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
А Б
Рис. 13.2. Пористый матрикс, полученный методом гель2сублимации.
А— общий вид матрикса (высота 10–15 мм, диаметр 3–5 мм). Б — пори2
стая микроструктура матрикса, сканирующая электронная микроскопия.
Пористость 95–99%
13.2. Гель%сублимация
В одной из первых раб от данного направ2
ления для изготовления пористого ма2
трикса использовали следующий подход:
полигликолевую кислоту растворяли в
хлористом метилене, после чего в полу2
ченный ра ств ор добавляли дистиллиро2
ванн ую воду для образования эмульсии.
Получившуюся смесь охлаждали жидким
азот ом. После охлаждения раствор вы2
сушивали при температуре –55
С для
°
13.3. Электроспиннинг
Одним из наиболее перспективных ме2
тодов изготовления матриксов для кле2
точной инженерии является метод элек2
троспиннинга. Использование электро2
спиннинга являет ся наиболее простым
и эффективным способом изготовления
полимерных нитей нанометрового диаме2
тра, из которых формируются матриксы с
очень высоким отношением поверхности
удаления диспергированной воды и рас2
творителя. После сушки получаемые ма2
триксы имели высокую степень пористо2
сти (до 95%) и размер пор от 13 до 35мкм
(рис. 13.2). Эти величины существенно
зависели от таких параметров, как отно2
шение объема растворителя к воде и вяз2
кости эмульсии. При соответствующем
подборе параметров в этом методе можно
менять как пористость, так и размер пор.
к объему. Вид установки для элект роспин2
нинга показан на рис. 13.3, А.
В процессе электроспиннинга раствор
полимера выдавливают через иглу неболь2
шого диаметра с постоянной скоростью в
электростатическое поле высокой напря2
женности. Этот процесс приводит к обра2
зованию полимерных нитей, из которых
в дальнейшем формируются полимерные
Глава 13. Технологии изготовления трехмерных матриксов… 295
Рис. 13.3. Электроспиннинг. А — установка для электроспиннин4
га (модель Nanon401А, MeccCo. LTD, Япония). Б — микрофотография
3D4матрикса из бактериального гомополимера полиоксибутирата. Диа4
метр волокон 100–2000 нм, диаметр пор 1–100 мкм, пористость 80–95%.
Сканирующая электронная микроскопия
А
Б
Наиболее современным методом из4
готовления матриксов является метод
3D4принтирования (рис. 13.4, А), в кото4
ром используется технология струйной пе4
чати, позволяющая создавать трехмерные
структуры с заранее заданной мор фологи4
ей (рис. 13.4, Б). Данный метод лишен не4
достатков многих традиционных методов
создания матриксов, так как позволяет на4
прямую задавать конечную структуру кон4
струируемого объекта. 3D4принтирование
не требует использования токсичных рас4
творителей и предоставляет возможность
работать с биологическими субстанция4
ми в естественной для них водной среде.
В этом методе, как и в обычном струйном
принтере, используют биочернила — это
могут быть белки, полимеры для созда4
ния матрикса или живые клетки. Исполь4
зуют также биобумагу — биосовместимую
поверхность, которая обеспечивает ста4
билизацию и существование созданных
пористые структуры, которые характери4
зуются хаотичностью формирующих их во4
локон субмикронного размера со средним
диаметром от десятков нанометров до де4
сятков микрометров (рис. 13.3, Б).
В настоящее время метод электроспин4
нинга успешно применяется для создания
матриксов как из синтетических полиме4
ров, так и из полимеров природного проис4
хождения. К основным достоинствам этого
метода можно отнести:
— возможность получать трехмерные ма4
триксы с высоким отношением поверх4
ности к объему;
— возможность ориентирования заряжен4
ных нитей в процессе изготовления ма4
трикса;
— относительная простота метода;
— возможность контролировать величину
пористости матриксов и толщину во4
локна плоской и цилиндрической кон4
фигурации.
13.4. 3D$принтирование
296 Часть V. Тканевая инженерия и регенеративная медицина, биоискусственные органы
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
А
Рис. 13.4. 3D9принтирование. А — общий вид 3D9принтера (модель
DMP92831), FUJIFILM Dimatrix Inc., США. Б — микрофотография на9
печатанного 3D9матрикса из коллагена 1 типа. Сканирующая электрон9
ная микроскопия
структур. При создании биомедицинских
клеточных продуктов сформированный на
3D9принтере матрикс вместе с предвари9
тельно выделенными и культивированны9
ми клетками помещают в СО
9инкубатор,
2
в котором при определенных условиях мо9
жет происходить формирование тканевых
структур. Методика обладает высокой вос9
Б
производимостью и достаточной точно9
стью, что делает возможным применение
контролируемой послойной печати. В про9
цессе биопринтир ования можно вносить в
матрикс факторы роста, цитокины, анти9
оксиданты и другие биомолекулы, необхо9
димые для прикрепления и дифференциа9
ции клеточного материала.
13.5. Метод поверхностно.селективного лазерного спекания
Принцип поверхностно9селективного ла9
зерного спекания (рис. 13.5, А) основан не
на объемном поглощении лазерного излу9
чения полимерным порошком, а на иници9
ировании процесса спекания полимерных
частиц (прозрачных для этого излучения)
введением в порошок малых (~ 0,1 вес.%)
добавок наночастиц углерода или золота,
эффективно поглощающих лазерное излу9
чение ближнег о инфракрасного диапазона
(=0,97мкм). При этом максимальная тем9
пература достигается на поверхности поли9
мерных частиц, быстро (вследствие низкой
теплопроводности последних) убывая к их
центру. Изменяя скорость сканирования
лазерного луча и его интенсивность, можно
осуществить спекание порошка и формиро9
вание трехмерной структуры за счет плав9
ления только поверхностных слоев частиц,
избегая существенного перегрева объема их
внутренних областей. Это дает возможность
формирования биорезорбируемых матриц
требуемой архитектоники для тканевой ин9
женерии из термолабильных полимерных
материалов (рис. 13.5, Б), практически пол9
ностью сохраняя химический состав и мо9
лекулярно9массовое распределение исх од9
ных полимерных частиц, а также позволяет
включать в них термически неустойчивые
биоактивные соединения.
Глава 13. Технологии изготовления трехмерных матриксов… 297
Рис. 13.5. Поверхностно*селективное лазерное спекание. А — принцип
метода поверхностно*селективного лазерного спекания полимерных ча*
стиц. Б — образцы матриксов, спеченные из порошка поли*D,L*лактида
с размерами частиц 250 мкм (а, б) и 100 мкм (в, г)
Лазерное излучение
Частицы
полимера
Зона нагрева
Наночастицы углерода или золота
А
Б
а
в
б
г
Глава 14
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
ПУТИ СОЗДАНИЯ
ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ
Трансплантация донорских органов оста2
ется основной надеждой хирургов при спа2
сении жизни пациентов с тяжелыми забо2
леваниями внутренних органов. Однако
главной проблемой является прогрессиру2
ющее увеличение числа пациентов в листе
ожидания, что диктует необходимость по2
иска альтернативных трансплантации спо2
собов лечения больных, к которым отно2
сятся разработки тканеинженерных кон2
струкций для частичного или полного за2
мещения функций пораженных или утра2
ченных органов.
В таблице14.1 представлены основные
направления исследований по созданию
той или иной биоискусственной системы,
а также перечислены сложности, возника2
ющие в процессе разработки соответству2
ющих ТИК, и используемые материалы.
В таблице14.2 перечислены наименова2
ния и состав некоторых тканеинженерных
продуктов, содержащих клеточные компо2
ненты и/или биоактивные молекулы, нахо2
дящиеся на различных этапах разработки.
Существует два основных подхода к соз2
данию ТИК из соответствующих клеточ2
ноинженерных конструкций (рис. 14.1).
Первый связан с использованием спе2
циального устройства — биореактора, обе2
спечивающего условия для дифференци2
ации и пролиферации клеток с последую2
щим формированием тканевых структур.
Второй путь заключается в использовании
в качестве биореактора организма реци2
пиента для формирования, по возможно2
сти, in situ ТИК непосредственно в живом
организме. Заметим, что при определен2
ных условиях имплантируемая клеточно2
инженерная конструкция будет выполнять
самостоятельную функцию (без формиро2
вания ТИК), заключающуюся в стимуля2
ции процессов регенерации поврежденных
тканей (рис. 14.2).
В качестве примера рассмотрим состав
клеточноинженерных конструкций хряще2
вой ткани, печени и поджелудочной желе2
зы и их функциональную эффективность
соответственно на экспериментальных мо2
делях о стеоартроза, хронической печеноч2
ной недостаточности и сахарного диабета
Iтипа с поражением этих тканей.
Роль каркаса (временного матрикса) в
клеточноинженерных конструкциях сустав2
ного хряща, печени и подже лу дочной желе2
зы (рис. 14.3) выполняет биополимерный
микрогетерогенный коллагенсодержащий
гидрогель (БМКГ). Этот гидрогель полу2
чают методом экстрагирования из тканей
животного происхождения с последующим
диспергированием и радиационной сшив2
кой (рис. 14.4). В состав БМКГ , относящего2
ся к классу биоактивных биомиметических
гидрогелей, входят как основные (пепти2
ды частично гидролизованного коллагена,
глико протеины и уроновые кислоты), так и
другие биологиче ски активные вещества. К
их числу принадлежат, например, факторы
роста, не обходимые для жизнедеятельности
окружающих клеток и синтеза экзогенных
уроновых кислот, протеогликанов, колла2
гена II типа. Наличие микрогетерогенной
структуры гидрогеля (рис. 14.5, А) позво2
лило увеличить время его биодеградации
до нескольких месяцев. Это время необхо2
димо для обеспечения жизнедеятельности
клеток. Время биодеградации БМКГ в не2
Глава 14. Пути создания тканеинженерных конструкций 299
Таблица 14.1
Примеры биоискусственных тканей и органов
Ткань /
орган
Особенности разработки
тканеинженерных систем
Используемые
биоматериалы
Кожа
Двухмерная ткань, культивирование клеток
относительно просто
Коллаген, полимолочная
кислота
Хрящ
Низкая васкуляризация трехмерного
внеклеточного матрикса. Хондроциты
жизнеспособны в среде с низким
содержанием кислорода и питательных
веществ, требуют трехмерного
культивирования
Коллаген, хондроитина
сульфат, полимолочная
кислота, гидроксиапатиты,
гетерогенные
коллагенсодержащие
гидрогели
Кость
Межклеточный матрикс имеет трехмерную
структуру, содержащую кровеносные сосуды.
Сложно поддерживать жизнеспособность
клеточных компонентов в трехмерной
структуре
Коллаген,
полимолочная кислота,
гидроксиапатит, кораллы,
βDтрикальцийфосфат,
αDтрикальцийфосфат,
децеллюляризированная
костная ткань
Поджелудочная
железа
Практически не содержит межклеточного
матрикса. Орган состоит из двух частей:
экзокринная система, синтезирующая
протеазы для пищеварения и эндокринная
система (островки Лангерганса),
секретирующая инсулин и другие гормоны.
Современные исследования направлены на
биоконструирование островков Лангерганса
Гидрофильные полимеры
(полиэтиленгликоль
и т. д.), гидрофобные
полимеры, силикатные гели,
коллаген, гетерогенные
коллагенсодержащие
гидрогели
Печень
Практически не содержит межклеточного
матрикса. Конструирование осложнено
наличием обширной сети кровеносных
сосудов и большим потоком крови
Гидрофильные полимеры
(полиэтиленгликоль
и т. д.), гидрофобные
полимеры, силикатные
гели, пористые апатиты,
коллаген, гетерогенные
коллагенсодержащие
гидрогели,
децеллюляризированная
ткань печени
Капилляры
и кровеносные
сосуды
Трубчатый каркас малого диаметра,
включающий три различные культуры клеток
Синтетические
биодеградируемые нанонити,
политетрафторэтилен,
децеллюляризированные
кровеносные сосуды
Соседние файлы в папке Библиотека им академика М.И. Перельмана