Современные методы исследования свойств сырья и продуктов животного происхождения. Лабораторный практикум. Учебное пособие

(Е 210), бензоат натрия (Е 211), бензоат калия (Е 212), бензоат кальция (Е 213), диоксид серы (Е 220), сульфит натрия (Е 221), гидросульфиты натрия и кальция (Е 222, Е 227), сульфиты калия и кальция (Е 225, Е 226), бисульфит калия (Е 228), дифенил (Е 230), ортофенилфенол (Е 231), тиабендазол (Е 233), муравьиная кислота (Е 236), формиат натрия и кальция (Е 237, Е 238), гексаметилентрамин (Е 239) и др.

Диоксид серы, сульфиты, бисульфиты, сернистая кислота – антимикробные вещества широкого профиля действия, подавляют рост плесневых грибов, дрожжей и аэробных бактерий. В кислой среде антимикробная активность этих веществ возрастает. Консервирующий эффект диоксида серы заключается в следующем: растворяясь в воде, он превращается в сернистую кислоту, которая проникает в липидно-протеиновую мембрану, выстилающую с внутренней стороны клеточную оболочку микроорганизма и переходит путём ультрафильтрации через мельчайшие поры этой полупроницаемой мембраны в плазму. При этом нарушается структура цитоплазматической оболочки, и клетка изменяется морфологически: происходят глубокое нарушение обмена веществ и гибель микробной клетки.

Сульфиты – ингибиторы дигидрогеназ, поэтому их используют в качестве отбеливающего материала при сушке картофеля, плодов и овощей, предохраняя таким образом продукты от потемнения. Однако, необходимо учитывать, соединения серы разрушают витамины (в частности, тиамин, биотин), а также важную аминокислоту тиамин, в связи с чем их целесообразно использовать для консервирования продуктов, содержащих значительное количество этих биологически активных веществ (мясные и молочные продукты, зерновые и т.д.).

Бензойная кислота содержится во многих плодах и ягодах (клюкве, бруснике), что определяет их высокую хранимоспособность, проявляет антимикробную активность, главным образом, в отношении дрожжей, плесеней и бактерий маслянокислого брожения. Её влияние несколько ниже на бактерии уксуснокислого брожения и молочнокислую флору. Консервирующее действие бензойной кислоты основано на способности ингибировать в

81

микробных клетках ферменты, ответственные за окислительновосстановительные реакции. Антимикробная активность бензойной кислоты повышается в кислой среде, поэтому она используется для консервирования плодово-ягодных изделий: соков, повидла, полуфабрикатов. К недостаткам бензойной кислоты следует отнести плохую растворимость в воде, что затрудняет её использование для консервирования, а также невысокую антисептическую активность (некоторые микроорганизмы вообще резистентны к её действию, а другие даже могут её утилизировать в качестве питательного субстрата). Поэтому на практике чаще всего используют хорошо растворимые соли бензойной кислоты бензоат натрия и бензонат калия.

Бензоаты натрия и калия проявляют высокую активность в кислой среде, они не летучи, поэтому их можно вносить в горячие продукты. Используются для консервирования рыбных изделий, маргарина, плодово-ягодных продуктов, напитков.

Консервирующими свойствами обладают парагидроксибензойная кислота и её эфиры (метиловый, этиловый, пропиловый), входящие в состав растительных алкалоидов и пигментов. Их антимикробная активность не зависит от рН среды, но эти соединения могут изменять вкусовые качества продуктов, поэтому используются для консервирования ограниченного числа изделий.

Сорбиновая кислота – соединение, близкое по строению к ненасыщенным жирным кислотам. Это кристаллическое вещество, плохо растворимое в холодной воде, проявляет фунгистатическое действие по отношению к дрожжам и плесеням, бактериальная микрофлора ею почти не уничтожается.

Сорбиновая кислота задерживает действие дегидрогеназной энзимной активности и проявляет наибольшую антимикробную и антигрибковую активность в кислой среде (рН > 5,5). В связи с тем, что спектр антимикробного действия сорбиновой кислоты частично ограничен, в ряде продуктов её рекомендуется сочетать с другими консервантами: бензоатом натрия, поваренной солью. Важным преимуществом сорбиновой кислоты является то, что она не изменяет органолептических характеристик

82

продуктов, не проявляет токсичных и канцерогенных свойств. Кроме того, сорбиновая кислота обладает благоприятным биологическим действием: повышает иммунологическую реактивность и детоксикологическую способность организма.

На практике сорбиновую кислоту, а также её калиевые, натриевые и кальциевые соли используют в качестве консервантов в безалкогольных напитках, плодово-ягодных соках, хлебобулочных кондитерских изделиях (мармелад, джемы, варенье, кремы), а также для предотвращения плесневения сыров, полукопченых колбас, потемнения сгущённого молока. Сорбиновой кислотой обрабатывают упаковочные материалы для пищевых продуктов.

Уротропин (гексаметилентрамин) – вещество, в состав которого входит формальдегид. Используется для консервирования ограниченного числа пищевых продуктов (икры рыб, колбасных оболочек), т.к. имеются данные о небезразличных для здоровья человека свойствах уротропина. Объединенным комитетом экспертов ФАО/ВОЗ гексаметилентрамин не рекомендуется в качестве пищевой добавки.

Муравьиная кислота относится к жирным кислотам и отличается высоким антимикробным действием, не изменяет органолептических свойств продукта. В пищевой промышленности нашли применение соли муравьиной кислоты – формиаты калия, кальция, натрия, которые иногда используют в качестве солезаменителей в диетическом питании.

Пропионовая кислота относится к группе жирных кислот, участвующих в цикле Кребса, в организме метаболизируется до пировиноградной кислоты. Пропионовая кислота, её калиевые, натриевые и кальциевые соли используются в качестве консервантов в хлебных и кондитерских изделиях, муке. Соли пропионовой кислоты нашли также применение в молочной промышленности, в частности, для предотвращения появления плесени на некоторых видах упакованных сыров.

Дифенил (орто-фенилфенол) – циклические соединения с выраженным фунгистатическим действием. Предотвращают развитие плесневых и других микроскопических грибов. Используются для продления сроков хранения цитрусовых, т.к. эти веще-

83

ства хорошо сорбируются кожурой плода. В результате термообработки или тщательного мытья цитрусовых плодов, значительная часть дифенила и орто-фенилфенола разрушается.

Диметил дикарбонат – вещество, обладающее широким спектром антимикробного действия. В водных растворах нестабилен, расщепляется с образованием метанола и диоксида. Целесообразно применять в качестве холодного стерилизующего агента при производстве фруктовых соков, безалкогольных напитков и вин.

Хлористый натрий или поваренная соль также проявляет фунгистатическое действие. Развитие гнилостных бактерий прекращается при концентрации соли 10 %, а при 20 – 25 % задерживается рост всех микроорганизмов. Консервирующее действие хлористого натрия основано на том, что он, повышая осмотическое давление в продукте, прекращает жизнедеятельность микроорганизмов, обезвоживая их клетки, препятствует развитию аэробных бактерий благодаря плохой растворимости кислорода в растворах хлористых солей. Соль блокирует центры белковых частиц, на которые не доступны действию большинства ферментов. Используются для консервирования рыбных, мясных продуктов.

При внесении консерванта в продукт необходимо учитывать следующие рекомендации:

∙эффективность и способы применения консервантов зависят от их химической структуры, концентрации, рН среды и свойств пищевого продукта, в который он вносится;

∙концентрацию консерванта рекомендуется уточнять в условиях конкретного производства;

∙при выборе консерванта необходимо учитывать его совместимость с другими компонентами продукта;

∙момент внесения консерванта зависит от технологии производства продукта. Внесение его в продукт сразу после тепловой обработки (пастеризации, стерилизации) считается оптимальным, так как под воздействием высоких температур уровень обсемененности микроорганизмами снижается, и добавка консерванта позволяет сохранять продукт длительное время;

84

∙если консервант вносится в пищевой продукт до тепловой обработки, то его дозировка должна быть увеличена, так как он может частично улетучиваться с паром;

∙в связи с индивидуальной антимикробной активностью,

внекоторых случаях целесообразно использовать консерванты в сочетании;

∙антимикробное действие консервантов усиливается в присутствии аскорбиновой кислоты;

∙рН среды влияет на антимикробную активность консервантов следующим образом: чем более кислый продукт, тем меньше в него требуется добавлять консерванта;

∙к продуктам пониженной калорийности количество добавляемого консерванта должно быть увеличено на 30 – 40 %, так как эти продукты, как правило, имеют высокое содержание воды и легко подвергаются порче;

∙количество консерванта может быть снижено в случае присутствия в продукте спирта и большого количества сахара.

Поскольку пищевые консерванты не составляют единого класса химических соединений, для них нельзя подобрать общий способ подготовки проб и общий метод анализа. Чтобы обнаружить наличие консерванта, можно использовать неспецифический микробиологический тест. Для этого в исследуемый продукт (иногда после соответствующего разбавления) вносят известные штаммы микроорганизмов, против которых активен предполагаемый консервант, и в течение определённого времени наблюдают, происходит ли размножение микроорганизмов. Многие из них (особенно дрожжи) выделяют углекислый газ, количество которого может быть измерено. Этот способ, под названием «тест на брожение», раньше имел определённое значение, однако сегодня применяется редко из-за недостаточной специфичности.

Современными методами определения пищевых консервантов в продуктах питания являются хроматографические, в частности, тонкослойная хроматография (ТСХ).

85

Хроматография – процесс, основанный на многократном повторении актов сорбции и десорбции вещества при перемещении его в потоке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента.

В методе ТСХ неподвижная твердая фаза тонким слоем наносится на стеклянную, металлическую или пластмассовую пластинку. В 2–3 см от края пластинки на стартовую линию вносят пробу анализируемой жидкости и край пластинки погружают в растворитель, который действует как подвижная фаза жидкостной адсорбционной хроматографии. Под действием капиллярных сил растворитель движется вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к их разделению. Диффузия в тонком слое происходит в продольном и поперечном направлениях, поэтому процесс следует рассматривать как двумерный.

Сорбционные свойства системы в ТСХ характеризуются подвижностью, т.е. величинойRf, которая рассчитывается из экспериментальных данных по уравнению

Rf = Хi/ Xf,

где Хi - расстояние от стартовой линии до центра зоны i-го компонента;

Xf - расстояние, пройденное за это же время растворителем.

Основные элементы установок ТСХ. Подложки для сор-

бента (пластинки) обычно изготавливают из стекла, алюминиевой фольги или полиэфирной пленки. В качестве сорбента в ТСХ применяют силикагели, оксид алюминия, крахмал, целлюлозу. Выбор растворителя зависит от природы сорбента и свойств анализируемых соединений. Часто применяют смеси растворителей из двух или трех компонентов. По окончании хроматографирования непроточным методом зоны на хроматограмме проявляют химическим или физическим способом. При химическом способе пластинку опрыскивают раствором реактива, взаимодействующего с компонентами смеси. В физических способах проявления используется способность некоторых веществ флуоресцировать под действием ультрафиолетового излучения, часто при добавле-

86

нии флуоресцирующего индикатора, взаимодействующего с компонентами смеси. После проявления хроматограммы приступают к идентификации веществ и дальнейшему анализу.

Качественный анализ в ТСХ. Наиболее общий подход к ка-

чественному анализу основан на значениях Rf. Хроматографическая подвижность является чувствительной характеристикой вещества, однако она существенно зависит от условий определения. При соблюдении стандартных условий получаются воспроизводимые значения Rf, которые можно использовать в аналитических целях при сравнении с табличными, если они получены в тех же условиях опыта.

Самым надежным является метод свидетелей, когда на стартовую линию рядом с пробой наносятся индивидуальные вещества, соответствующие предполагаемым компонентам смеси. Влияние различных факторов на все вещества будет одинаковым, поэтому совпадение Rf компонента пробы и одного из свидетелей дает основание для отожествления веществ с учетом возможных наложений. Несовпадение Rf интерпретируется более однозначно: оно указывает на отсутствие в пробе соответствующего компонента. На практике стандартное вещество (свидетель) в том же растворителе наносится на стартовую линию вместе с анализируемой пробой и хроматографируется в тех же условиях.

Количественный анализ в ТСХ. Количественные определе-

ния в ТСХ могут быть сделаны непосредственно на пластинке, либо после удаления вещества с пластинки. При непосредственном определении на пластинке измеряют тем или иным методом площадь пятна (например, с помощью миллиметровой кальки) и по заранее построенному градуировочному графику находят количество вещества.

Наиболее точным считается метод, в котором вещество после разделения удаляется с пластинки и анализируется спектрофотометрическим или иным методом. Удаление вещества с пластинки обычно производят механическим путем, хотя иногда применяют вымывание подходящим растворителем.

87

Порядок выполнения работы

1. Качественное определение бензойной и сорбиновой кислот методом тонкослойной хроматографии.

Метод основан на извлечении бензойной кислоты (БК) и сорбиновой кислоты (СК) из пищевых продуктов перегонкой с паром или экстракцией органическим растворителем с последующим хроматографическим разделением их в тонком слое сорбента, элюации и измерении оптической плотности полученных элюатов.

Пробу продукта (кроме напитков) массой около 10 г отвешивают с точностью до 0,01 г, измельчают и гомогенизируют с добавкой 25 г Na2SО4 и 40 см31 моль/ дм3 H2SО4. Гомогенат переносят в колбу вместимостью 1дм3, соединенную с парообразователем и нагревают. В момент, когда жидкость в колбе начинает закипать, закрывают парообразователь пробкой и отгоняют БК и СК с паром, собирая около 80 см3 дистиллята в приемник, содержащий 10 см31 моль/ дм3 NaOH. Дистиллят переносят в делительную воронку насыпают Na2SО4 (на 10 см3 дистиллята добавляют 6 г Na2SО4), подкисляют 1 моль/ дм3 H2SО4 до рН 2,0÷3,0 и экстрагируют этилацетатом трижды по 10 см3. Объединенный экстракт сушат, добавляя 2 г прокаленного безводного Na2SО4. Этот экстракт обозначают Vi. Экстракт упаривают на ротационном испарителе (допускается упаривание в фарфоровой чашке на песчаной бане) до объема 1 см3.

При анализе напитков исключают стадию отгонки, 10 см3напитка разбавляют вдвое 0,5 моль/ дм3 H2SО4, добавляя 10 г Na2SО4, интенсивно перемешивают и экстрагируют БК и СК 3 раза по 5 см3 этилацетатом. Объединенный экстракт (Vi) сушат 1 г безводного прокаленного Na2SО4. Экстракт упаривают на ротационном испарителе или в фарфоровой чашке до конечного объема 1см3.

Идентификация кислот. Готовят смесь растворителей: петролейный эфир-хлороформ-диэтиловый эфир-муравьиная кислота, в отношении объемов 20,0:8,0:2,8:1,2 и заливают в камеру

88

для тонкослойной хроматографии. Пластинку «Силуфол Уф 254» размечают мягким простым карандашом и в точки 1, 4, вносят по 2 и 4 мм3 раствора 3, при этом количество БК в пятнах составляет 4 и 8 мкг, а СК - 0,4 и 0,8 мкг соответственно. В точки 2 и 3 вносят 3 и 10 мм3 экстракта. Нанесение проб проводят микрошприцем или калиброванным капилляром с постоянным поддувом воздухом с помощью, например, фена. Диаметр пятна на старте не должен превышать 2-3 мм. Пластинку опускают в камеру и хроматографируют до 15 см от линии старта. Затем пластинку вынимают, подсушивают и рассматривают в УФ-свете с волной 254 нм. Наличие темных пятен в экстракте по Rf соответствующим стандартам свидетельствует о присутствии этих консервантов в продукте. Пятна в экстракте сравнивают с пятнами стандартов визуально и ориентировочно оценивают содержание бензойной и сорбиновой кислот в пробе. Темные пятна в экстракте и стандартах обводят карандашом в УФ-свете.

Бензойная кислота. Высушенную пластинку разрезают между точками 3 и 4. Одну часть опрыскивают раствором хлорного железа, а затем - пероксида водорода и нагревают 2 мин при 80100 °С в сушильном шкафу. Появление буро-фиолетовой окраски пятен на хроматограмме экстракта, по цвету и Rf соответствующих пятнам в стандарте БК, подтверждает наличие БК в пробе.

Сорбиновая кислота. Вторую часть пластинки опрыскивают раствором К2Сr2О4 в H2SО4, подсушивают, опрыскивают раствором 2-тиобарбитуровой кислоты и нагревают 5 мин при 100 °С в сушильном шкафу. Появление малиновой окраски пятен на хроматограмме экстракта, по цвету и Rf соответствующих пятнам в стандарте СК подтверждает ее наличие в пробе.

2. Количественное определение бензойной кислоты.

Сущность метода определения бензойной кислоты и бензоата натрия сводится к приготовлению водной вытяжки из исследуемого продукта, осаждению из нее белковых веществ, экстракции бензойной кислоты из водной вытяжки хлороформом с последующим титрованием.

89

Для проведения анализа готовят водную вытяжку в мерной колбе на 250 см3 из навески продукта массой 20-50 г (если продукт твердый его измельчают).

Добавляют по каплям раствор с массовой долей NaOH 10 % до щелочной среды (проба по лакмусовой бумаге).

Для осаждения белковых веществ прибавляют 5-10 см3 К4(Fe(СN)6) и 5-10 см3 ZnSO4. Содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой, энергично перемешивают и через 5 мин фильтруют. Затем 100 см3 фильтрата помещают в делительную воронку, нейтрализуют раствором с массовой долей НСl10 % до нейтральной реакции, после чего добавляют еще 5 см3 НСl. Бензойную кислоту экстрагируют 4 раза хлороформом по 40-50см3; продолжительность каждой экстракции 15-20 мин. Взбалтывание проводят круговыми вращательными движениями через каждые 5 мин.

После каждой экстракции хлороформенные вытяжки собирают в одну колбу и затем отгоняют ¾ объема хлороформа на водяной бане при 65 °С, после чего остаток вытяжки переносят в фарфоровую чашку и выпаривают досуха при температуре 40-50 °С. При попадании в вытяжку водного слоя необходимо хлоро-

форменный слой промыть дистиллированной водой 2 раза по 5 см3.

Остаток бензойной кислоты в чашке растворяют в 3050 см3спирта (нейтрализованного по фенолфталеину), прибавляют 10 см3 дистиллированной воды, 2-3 капли фенолфталеина и титруют 0,05 моль/дм3 раствором NaOH. 1 см3 раствора NaOH соответствует 0,0061 г бензойной кислоты или 0,0071 г бензоата натрия.

Массовая доля бензойной кислоты Х, %,:

100·V·C·M·V1

X =,

1000·V2

где V - объем NaOH, израсходованный на титрование, см3; C - молярная концентрация раствора NaOH, моль/дм3;

90